Tol2轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的斑馬魚(yú)基因誘變、篩選及斑馬魚(yú)胚盾特異表達(dá)基因的鑒定.pdf

1、斑馬魚(yú)是一種優(yōu)良的模式動(dòng)物，其胚胎發(fā)育過(guò)程受到很多基因和信號(hào)通路的參與和調(diào)控，非常適合用來(lái)做發(fā)育生物學(xué)方面的研究以及疾病遺傳模型構(gòu)建等。突變體作為一種基因功能缺失，是研究基因功能和揭示發(fā)育機(jī)制的重要工具。為深入探究斑馬魚(yú)胚胎的發(fā)育過(guò)程、了解其中的發(fā)育機(jī)制，并尋找更多斑馬魚(yú)發(fā)育的研究素料，本論文研究通過(guò)Tol2轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的基因捕獲技術(shù)獲得綠色熒光蛋白(GFP)基因特異性表達(dá)的轉(zhuǎn)基因魚(yú)品系。進(jìn)一步篩選到斑馬魚(yú)胚胎發(fā)育相關(guān)的突變體，鑒定出發(fā)生

2、突變的相關(guān)基因，并對(duì)其在胚胎發(fā)育過(guò)程中作用和功能做了初步分析。
　　本次實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)斑馬魚(yú)單細(xì)胞顯微注射Tol2質(zhì)粒和mRNA，共捕獲到6種特異表達(dá)GFP的轉(zhuǎn)基因魚(yú)品系，我們對(duì)其中2種熒光出現(xiàn)較早的品系進(jìn)行了MZ（母源合子）純合體篩選，發(fā)現(xiàn)其一種突變體在母源純合體時(shí)有外包缺陷，另一種純合體雖然沒(méi)有觀察到與該基因一致的表型，但是該品系熒光在神經(jīng)系統(tǒng)特異表達(dá)，可以作為研究神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的有力工具，并且在其中一條F2代雌魚(yú)的子代中觀察到脊椎

3、發(fā)育缺陷。
　　Tol2:20141017m品系的熒光分布具有一定的時(shí)空特異性，該品系轉(zhuǎn)基因魚(yú)的熒光在母源和合子期都有表達(dá)，在胚盾時(shí)期表達(dá)在邊緣區(qū)域，體節(jié)期間主要表達(dá)在脊索和體節(jié)，受精后24 h表達(dá)在生肌節(jié)和卵黃合胞體。利用TAIL-PCR分析，鑒定到所捕獲的基因?yàn)閟i: ch73-52f24.4。根據(jù)與Ensembl中數(shù)據(jù)比對(duì)發(fā)現(xiàn)si: ch73-52f24.4有三個(gè)轉(zhuǎn)錄本，但都不能編碼蛋白。Tol2轉(zhuǎn)座子插入到si:ch73-

4、52f24.4的前兩個(gè)轉(zhuǎn)錄本的第一個(gè)內(nèi)含子中，因轉(zhuǎn)座子中自帶了尾巴結(jié)構(gòu)，阻斷了這兩個(gè)轉(zhuǎn)錄本的正常表達(dá)，而第三個(gè)轉(zhuǎn)錄本從位置上看不受到影響。該轉(zhuǎn)基因突變體的母源純合體胚胎在外包過(guò)程中有明顯的缺陷:外包過(guò)程時(shí)間延長(zhǎng)、卵黃無(wú)法被完全吸收，尾芽變得扁平，一部分胚胎甚至無(wú)法發(fā)育到體節(jié)期，而能夠正常發(fā)育到24 h的胚胎的身體長(zhǎng)度較野生型短。所以我們初步分析si:ch73-52f24.4是一種重要的影響外包過(guò)程的母源的長(zhǎng)鏈非編碼RNA，它可能對(duì)于胚層

5、的分化以及體節(jié)的發(fā)育都有很重要的影響。
　　Tol2:20141221t品系的熒光在神經(jīng)系統(tǒng)中特異表達(dá)，表達(dá)部位主要集中在腦部和脊椎上側(cè)，使用TAIL-PCR和5'RACE鑒定發(fā)現(xiàn)所捕獲的基因?yàn)閟at1.a。它是一種亞精胺/精胺N1-乙酰轉(zhuǎn)移酶（spermidine/spermineN1-acetyltransferase），在斑馬魚(yú)中有三種同源基因。Tol2轉(zhuǎn)座子插入到第8個(gè)內(nèi)含子中，致使sat1.a基因轉(zhuǎn)錄提前終止。目前在F2

6、代純合體沒(méi)有觀察到與該基因一致的發(fā)育缺陷，但同時(shí)也發(fā)現(xiàn)4條雌魚(yú)中有一條產(chǎn)生的后代脊椎全都是彎曲的。然而這種突變類(lèi)型與熒光所在位置并不一致，目前我們還沒(méi)有弄清楚是否與該基因有關(guān)，如果無(wú)關(guān)，又是什么基因發(fā)生了突變。
　　綜上論述，Tol2轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的基因捕獲技術(shù)作為正向遺傳學(xué)研究工具的可行性，本課題成功地捕獲到一種lncRNA，這是以前沒(méi)有人報(bào)道過(guò)的，為我們研究lncRNA提供了一種新素材;另外在神經(jīng)系統(tǒng)表達(dá)的品系可以作為一種非常好的