農(nóng)桿菌介導(dǎo)的Ac-Ds轉(zhuǎn)座子大豆突變?nèi)后w的構(gòu)建.pdf

1、大豆是重要的油料作物，也是人類(lèi)膳食中植物蛋白質(zhì)的主要來(lái)源。突變體是克隆基因和研究基因功能的良好材料，創(chuàng)造突變體庫(kù)對(duì)于植物功能基因組學(xué)研究具有十分重要的意義。用轉(zhuǎn)座因子標(biāo)簽法分離基因不需要預(yù)先知道被標(biāo)簽基因產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)、性質(zhì)，因此那些背景尚不清楚的如發(fā)育、抗病及與生理過(guò)程有關(guān)的基因都有可能用此方法來(lái)分離。90年代由于植物組織培養(yǎng)與外源基因轉(zhuǎn)化技術(shù)的發(fā)展，已可以將一種植物的轉(zhuǎn)座因子導(dǎo)入到另一種植物中，并證明轉(zhuǎn)座因子在異源植物中也能轉(zhuǎn)座，這樣用

2、轉(zhuǎn)座因子標(biāo)簽法來(lái)分離基因更加受到重視。目前，插入突變?cè)谥参锏墓δ芑蚪M研究中己得到廣泛應(yīng)用。 眾所周知，大豆的遺傳轉(zhuǎn)化體系建立的極其困難，其主要原因是：1.難以建立高效的植株再生體系，沒(méi)有理想的適合遺傳轉(zhuǎn)化的再生系統(tǒng)。2.遺傳轉(zhuǎn)化效率低、重復(fù)性差。因此大豆難以象擬南芥和水稻那樣通過(guò)T-DNA插入獲得大量突變體。而利用Ac/Ds轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽技術(shù)，則只需將Ac和Ds元件分別轉(zhuǎn)入大豆，通過(guò)Ac和Ds轉(zhuǎn)化系的雜交，借助轉(zhuǎn)座子在分離世代中的

3、轉(zhuǎn)座，獲得大量的突變體，從而構(gòu)建大豆突變?nèi)后w。 本研究利用基因工程手段，采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法，探討了提高大豆植株再生和遺傳轉(zhuǎn)化效率的影響因子，建立了穩(wěn)定的植株再生和遺傳轉(zhuǎn)化體系，獲得了Ac和Ds抗性轉(zhuǎn)基因T0代植株940株，轉(zhuǎn)基因T2代植株8000余株，在研究過(guò)程中鑒定出十幾個(gè)表型突變體，并對(duì)這些表型突變體進(jìn)行了初步分析，為大豆突變?nèi)后w的構(gòu)建、突變基因克隆和大豆功能基因組學(xué)研究奠定了基礎(chǔ)。具體研究結(jié)果如下： 1.以吉林小粒1

4、號(hào)子葉節(jié)為外植體，進(jìn)行叢生芽誘導(dǎo)和農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化試驗(yàn)。通過(guò)優(yōu)化叢生芽誘導(dǎo)、伸長(zhǎng)和生根3個(gè)階段合適的培養(yǎng)基配比，在6-BA濃度為1.7mg/L時(shí)，吉林小粒1號(hào)叢生芽誘導(dǎo)率最高，平均為93.2％。當(dāng)IBA濃度達(dá)到1.5mg/L時(shí)，外植體的生根率最高，為79.8％。 2.對(duì)比實(shí)驗(yàn)表明氯氣熏蒸的消毒方法優(yōu)于升汞消毒，萌發(fā)率與消毒時(shí)間成反比。利用nptⅡ基因和hpt作為選擇標(biāo)記基因，在叢生芽誘導(dǎo)階段Km的最適篩選濃度為50mg/L，在芽伸長(zhǎng)階

5、段Km的合適篩選濃度為30mg/L。在叢生芽誘導(dǎo)階段HygromycinB的最適篩選濃度為20mg/L，在芽伸長(zhǎng)階段HygromycinB的合適篩選濃度為10mg/L。 3.農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)中，當(dāng)外植體保留2/3或3/3子葉時(shí)，叢生芽分化數(shù)量多、生長(zhǎng)速度較快，對(duì)農(nóng)桿菌的抑制效果也有一定影響。轉(zhuǎn)化試驗(yàn)結(jié)果表明，共培養(yǎng)pH值、負(fù)壓處理時(shí)間、共培養(yǎng)時(shí)間、預(yù)培養(yǎng)時(shí)間都影響轉(zhuǎn)化效率，影響程度依以上順序遞減。最佳處理組合為侵染前外植體4℃低溫

6、預(yù)處理1天、侵染時(shí)0.06Mpa抽真空5分鐘、共培養(yǎng)3天、共培養(yǎng)培養(yǎng)基pH值為5.4。 4.除菌試驗(yàn)中羧芐青霉素(Cb)(德國(guó)進(jìn)口)和Cef(國(guó)產(chǎn))，兩者混合使用，農(nóng)桿菌污染率一直低于單獨(dú)使用Cef,叢生芽的誘導(dǎo)率高于單獨(dú)使用Cef。 此轉(zhuǎn)化體系抗性芽率可達(dá)68.1％，伸長(zhǎng)率為34.1％，生根率為27.2％，巴龍霉素離體檢測(cè)陽(yáng)性率為15.3％，PCR陽(yáng)性率為9.4％，Southern雜交結(jié)果證明外源基因已經(jīng)整合入大豆基因

7、組。本研究建立了穩(wěn)定的大豆子葉節(jié)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化體系，同時(shí)該流程操作簡(jiǎn)便，比較適合規(guī)模化遺傳轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)。 5.本研究采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法，以吉林小粒1號(hào)子葉節(jié)為受體材料，將玉米Ac/Ds轉(zhuǎn)座子，共3個(gè)載體，成功轉(zhuǎn)化到大豆基因組中。對(duì)轉(zhuǎn)化植株進(jìn)行了PCR檢測(cè)、Southerndotblot分析、Southern雜交分析等分子生物學(xué)檢測(cè)，測(cè)序結(jié)果證明Ac/Ds已經(jīng)整合到大豆基因組中，共計(jì)獲得轉(zhuǎn)化植株940株，其中Ac轉(zhuǎn)基因植株340株，Ds

8、G轉(zhuǎn)基因植株300株，DsE轉(zhuǎn)基因植株300株。 6.轉(zhuǎn)基因材料中篩選單拷貝插入，Ac34份、Ds38份，自交純合，獲得獨(dú)立起始基因系。 7.構(gòu)建了Ac×Ds雜交群體，從分子水平上證明了雜交后代中轉(zhuǎn)座因子在大豆基因組中的存在，且于GenBank中的數(shù)據(jù)一致。雜交群體擴(kuò)繁，建立了大豆Ds突變?nèi)后w。 8.轉(zhuǎn)基因植株后代出現(xiàn)了十幾種類(lèi)型的可見(jiàn)突變體，有些屬于非插入突變。利用分子生物學(xué)方法對(duì)葉形突變材料、花色突變材料、成