硫化氫對胰島素抵抗的作用及其機(jī)制.pdf

1、硫化氫(H2S)是一種無色有臭雞蛋味的氣體，大量吸入會(huì)導(dǎo)致中毒。然而，很多種哺乳動(dòng)物細(xì)胞自身能產(chǎn)生H2S，在正常大鼠的血液中H2S濃度達(dá)到46μmol/L。體內(nèi)的H2S主要通過含硫氨基酸的代謝產(chǎn)生，胱硫醚-β-合酶(cystathionineβ-synthase，CBS)和胱硫醚-γ-裂解酶(cystathionineγ-lyase,CSE)是兩個(gè)能分解L-半胱氨酸產(chǎn)生硫化氫的酶。
　　內(nèi)源性H2S已被證實(shí)與心血管系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、

2、胃潰瘍和感染等的發(fā)病相關(guān)，最近的研究提示H2S與糖尿病有一定的相關(guān)性。研究發(fā)現(xiàn)，在STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠中，胰腺中內(nèi)源性H2S的產(chǎn)量顯著增加。但也有文獻(xiàn)報(bào)道非肥胖糖尿病小鼠(NOD)體內(nèi)H2S的生物合成隨著病情進(jìn)展而逐漸減少。最新研究提示H2S可以通過開放ATP敏感的鉀離子(KATP)通道影響胰島素的釋放。但到目前為止，還沒有文獻(xiàn)證實(shí)H2S是否對葡萄糖代謝以及胰島素抵抗有影響。
　　胰島素抵抗是2型糖尿病重要的病理生理特征，主要表

3、現(xiàn)為胰島素的靶組織（肝臟、肌肉、脂肪組織）對胰島素敏感性及反應(yīng)性降低。胰島素抵抗是糖尿病及其并發(fā)癥發(fā)病的中心環(huán)節(jié)，因而，改善胰島素抵抗具有重要的臨床意義。目前已經(jīng)有報(bào)道H2S可能參與糖尿病的病理過程，那么H2S是否對胰島素抵抗有影響呢？我們通過研究H2S與胰島素抵抗的關(guān)系可以更全面的了解這個(gè)新型氣體信號分子。
　　本課題選用L6骨骼肌細(xì)胞和3T3-L1脂肪細(xì)胞進(jìn)行相關(guān)研究。MTT結(jié)果表明高濃度(500-1000μmol/L)的H2

4、S供體硫氫化鈉(NaHS)使細(xì)胞活力顯著下降，而低濃度(10-200μmol/L)則對細(xì)胞活力沒有影響，說明高濃度的H2S可能存在細(xì)胞毒性。所以在之后的葡萄糖消耗和葡萄糖攝取實(shí)驗(yàn)中NaHS給藥濃度都在此范圍內(nèi)(≤200μmol/L)。
　　我們選用葡萄糖消耗和葡萄糖攝取的方法來評價(jià)細(xì)胞對葡萄糖的攝取和利用能力。葡萄糖消耗結(jié)果顯示，對于脂肪細(xì)胞和骨骼肌細(xì)胞，低濃度(10-100μmol/L)的H2S供體硫氫化鈉(NaHS)可以在胰島

5、素刺激下增加培養(yǎng)基中葡萄糖的消耗，但對于基礎(chǔ)狀態(tài)的葡萄糖消耗沒有影響。葡萄糖攝取實(shí)驗(yàn)可以準(zhǔn)確的評價(jià)細(xì)胞對胰島素的敏感性。為了全面了解H2S對正常和病理狀態(tài)下脂肪細(xì)胞和骨骼肌細(xì)胞的葡萄糖攝取，我們參照文獻(xiàn)中的方法建立了胰島素抵抗細(xì)胞模型（IR模型）。我們檢測了H2S對正常細(xì)胞和胰島素抵抗模型細(xì)胞(IR模型)中基礎(chǔ)狀態(tài)和胰島素刺激情況下的葡萄糖攝取的作用。結(jié)果表明，低濃度(10-100μmol/L)的H2S供體硫氫化鈉(NaHS)可以顯著提

6、高骨骼肌細(xì)胞和脂肪細(xì)胞在胰島素刺激作用下的葡萄糖攝取，且這種作用在正常細(xì)胞和IR模型細(xì)胞中都存在。說明H2S可以在一定劑量范圍內(nèi)增加這兩種細(xì)胞的葡萄糖攝取，且這種作用依賴于胰島素的存在。
　　在此基礎(chǔ)上，我們進(jìn)一步探討了H2S促進(jìn)葡萄糖攝取的機(jī)制。葡萄糖攝取實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明H2S只有在胰島素刺激下才能增加兩種細(xì)胞的葡萄糖攝取，提示H2S的作用可能與胰島素的信號通路有關(guān)。我們檢測了H2S對胰島素信號通路關(guān)鍵蛋白的磷酸化的影響。Weste

7、rn blot方法顯示H2S能促進(jìn)胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的胰島素受體、PI3K、Akt的磷酸化，并具有時(shí)間和濃度依賴性。預(yù)先給予骨骼肌細(xì)胞和脂肪細(xì)胞PI3K的阻斷劑LY294002后，H2S在胰島素刺激下的促進(jìn)葡萄糖攝取的效應(yīng)被完全阻斷。說明H2S增加葡糖攝取的作用可能通過IR/PI3K/Akt通路。對于另外兩條通路中的關(guān)鍵蛋白，Cb1、ERK、P38和JNK，H2S未能促進(jìn)其磷酸化。
　　胰島素受體信號通路轉(zhuǎn)導(dǎo)促使葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4(

8、glucose transporter，GLUT4)從細(xì)胞漿內(nèi)轉(zhuǎn)位至細(xì)胞膜，將葡萄糖從胞外攝入細(xì)胞內(nèi)，協(xié)助維持機(jī)體血糖的穩(wěn)定?？梢姡珿LUT4在葡萄糖的轉(zhuǎn)運(yùn)和攝取中起著很關(guān)鍵的作用。H2S可以增加IR/PI3K/Akt通路的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，那么H2S是否可以影響GLUT4的表達(dá)及轉(zhuǎn)位呢？我們發(fā)現(xiàn)H2S確實(shí)可以增加胰島素刺激引起的GLUT4的轉(zhuǎn)位，但對其表達(dá)沒有影響。
　　最后，在整體水平觀察H2S對2型糖尿病GK大鼠體內(nèi)胰島素抵抗的影響

9、。不同濃度NaHS(30，60以及120μmol/kg/d)通過腹腔注射給藥，持續(xù)8周。我們發(fā)現(xiàn)低劑量NaHS(30μmol·kg-1·d-1)可以改善GK大鼠的胰島素抵抗，降低空腹血糖(FBG)，增加葡萄糖耐量和胰島素敏感性。而高劑量NaHS(120μmol·kg-1·d-1)給藥后則加重了GK大鼠的胰島素抵抗，空腹血糖升高，葡萄糖耐量降低。與文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)不同的是，NaHS對GK大鼠的胰島素分泌沒有影響。以上結(jié)果說明H2S在不同劑量時(shí)對于