新型細胞聚集體的構建及其應用于軟骨組織再生的實驗研究.pdf

1、由創(chuàng)傷、先天性畸形和手術切除病變等原因造成的軟骨缺損給患者的生存質量帶來很大的影響。常用的修復方法如自體、異體軟骨移植、人工替代物修復等，都有一定的局限性。所以，軟骨缺損的修復和治療一直是困擾臨床醫(yī)生的一個難題。而軟骨組織工程技術的出現(xiàn)和發(fā)展，為解決這些問題提供了可能。 傳統(tǒng)概念中，軟骨組織工程技術研究領域主要包括種子細胞、支架材料、生長因子三方面內容。經(jīng)過近20 年的研究，軟骨組織工程研究已經(jīng)取得了長足的進展。人們逐漸認識到模

2、擬組織發(fā)育進行組織構建的重要性，以及應該盡量避免使用異體、異種材料，并已經(jīng)在進行積極的研究和探索。 本課題提出了新的軟骨細胞構建方法---軟骨細胞聚集體(ChondrocyteMacroaggregate)技術，其主要策略是利用分離的原代細胞和擴增后的軟骨細胞按照特定的培養(yǎng)程序在體外構建出的細胞-自分泌基質復合體，擴增的軟骨細胞在原代細胞分泌的細胞外基質表面上粘附并實現(xiàn)三維立體生長，它的優(yōu)勢在于：1.保持了擴增細胞良好的功能表

3、型，在細胞數(shù)量增加的同時兼顧了細胞的分化能力；2.良好的生物相容性和低免疫源性；3.高的細胞利用效率；4.通過與天然基質材料結合，可以進行特定形態(tài)的組織構建。 實驗對構建軟骨細胞聚集體的理化性質、組織學結構和生化成分進行了分析；通過體外三維構建和動物實驗評估了軟骨細胞聚集體體外軟骨形成能力和體內形成特定形態(tài)軟骨的能力。進一步，提出內支撐體結合細胞聚集體的三維構建策略，研究可吸收性內支撐體的構建方法，探索新的特定形態(tài)軟骨組織的構建

4、思路。 實驗一軟骨細胞聚集體的構建以及組織形態(tài)學觀察 目的：通過兩步細胞沉淀法制備軟骨細胞聚集體, 并檢測制備效果和質量。 方法：切取兔耳軟骨組織，通過酶消化法制備原代軟骨細胞，將原代細胞進行細胞計數(shù)并分為三等分，取1/3 平均接種至3 個六厘米直徑培養(yǎng)皿中，構建單層軟骨細胞膜片。其他細胞接種至75 cm2 培養(yǎng)瓶中，擴增培養(yǎng)十天，待細胞長滿瓶底，消化，搜集細胞。將獲取細胞高密度接種至生長有軟骨細胞膜片的培養(yǎng)皿

5、上。孵育十四天后，觀察軟骨細胞聚集體的形成情況和理化性能，并進行組織學染色和電鏡觀察。 結果：經(jīng)過體外孵育，軟骨細胞聚集體為半透明膜狀物，質有彈性，可用金屬鑷鉗夾操作。HE染色證實有幼稚的軟骨基質形成，并形成類似軟骨陷窩樣的組織結構。番紅-O染色證實有糖胺聚糖成分在基質中合成。 結論：將原代軟骨細胞和傳代的軟骨細胞做共培養(yǎng)，有利于傳代細胞的表型恢復，并可以形成結構均勻的軟骨細胞聚集體。形成的聚集體含有大量細胞外基質，且

6、具有一定的機械強度，可以用于組織工程軟骨的構建。 實驗二軟骨細胞聚集體體外構建軟骨組織 目的：在外支架構建策略下，觀察軟骨細胞聚集體體外發(fā)育成軟骨組織的能力。 方法：靜態(tài)培養(yǎng)條件下，將軟骨細胞聚集體移入圓柱形金屬網(wǎng)外支架中，進行體外孵育4 周后，觀察聚集體之間的融合情況，并通過組織學染色觀察組織成熟情況。 結果：大體觀察，體外孵育四周后，在構建體外周部分的軟骨細胞聚集體發(fā)生了組織融合，并形成了比較成熟的軟

7、骨組織，而在構建體的中央部分，軟骨聚集體之間的分層非常明顯，沒有形成成熟的軟骨組織。 結論：在營養(yǎng)交換良好的環(huán)境下，軟骨細胞聚集體具備繼續(xù)成熟并發(fā)育為軟骨組織的能力，外支架策略為軟骨細胞聚集體的體外三維構建提供了塑形的方法。 實驗三軟骨細胞聚集體構建氣管軟骨的實驗研究 目的：利用外支撐技術結合軟骨細胞聚集體技術，在動物體內構建出管狀軟骨，以檢測軟骨細胞聚集體體內構建特定形態(tài)軟骨的能力。 方法：按實驗一所

8、述方法構建出軟骨細胞聚集體后，以硅膠管為外支撐體，將其均勻纏繞在硅膠管外表面。體外短時間孵育，使軟骨細胞聚集體與硅膠管牢靠貼附后，將構建的管狀移植體植入細胞供體動物（新西蘭兔）背部皮下。體內孵育8周后，取出標本。從大體形態(tài)，組織學結構、免疫組化以及GAG 含量、生物力學性能等方面評價形成軟骨的質量。 結果：通過此策略構建的管狀軟骨具有良好的生物相容性，未見免疫炎癥反應產生。形成的軟骨保持著良好的管狀外形，組織學結構類似于天然軟骨

9、，含有豐富的蛋白多糖和膠原纖維。 結論：軟骨細胞聚集體在體內具有良好的軟骨形成能力。形成的組織結構均勻，細胞表型維持良好，并為氣管軟骨的再造提供了新的方法。 實驗四仿生細胞外基質的構建及其作為內支撐體的可行性研究 目的：制備出具有軟骨形成能力、塑形性強且有一定機械性能的仿生細胞外基質，為構建可吸收性內支撐體提供技術支持。 方法：選擇透明質酸酯無紡網(wǎng)樣支架和膠原凝膠作為基質材料。分離兔軟骨細胞，體外擴增、

10、收獲后，以一定的細胞濃度與液態(tài)膠原共混，將其接種進入透明質酸酯無紡網(wǎng)樣支架中，待形成細胞凝膠共聚體后，繼續(xù)進行體外孵育。觀察細胞孵育過程中細胞仿生細胞外基質形態(tài)變化情況、內部細胞增殖和形態(tài)變化情況。 結果：通過上述策略，可以形成形態(tài)穩(wěn)定的細胞基質共混體，細胞在內部具有良好的表型和均勻的分布。形成的細胞基質共混體可有個體性的形態(tài)，有一定的機械性能，可成為可吸收性內支撐體。 結論：透明質酸酯-膠原凝膠可以構建出軟骨細胞移植體

11、，并為細胞聚集體提供形態(tài)支撐的技術平臺。 實驗五軟骨細胞聚集體構建人鼻翼軟骨的研究 目的：運用仿生細胞外基質-軟骨細胞聚集體構建策略，在有免疫動物體內構建鼻翼外形軟骨。 方法：以新西蘭兔為動物模型，取自體軟骨細胞，體外擴增、收獲后，分別構建鼻翼外形的仿生細胞外基質內支撐體和軟骨細胞聚集體。然后，將軟骨細胞聚集體小心纏繞在內支撐體外周。與此對照，構建鼻翼外形金屬網(wǎng)外支架，將細胞聚集體離心于外支架中體外孵育。將兩種方

12、法獲得的鼻翼軟骨移植體分別植入動物體內，12 周后，取出標本，進行大體外形、組織學形態(tài)、生物化學以及生物力學性能分析，并比較兩種策略構建出的軟骨質量的差別，以篩選出合適的構建策略。 結果：通過內支撐體構建的軟骨移植體具有穩(wěn)定的外形，能在動物體內形成外形理想的鼻翼軟骨，組織學結構、生物化學以及生物力學指標均顯示構建的軟骨具有良好的質量，可以滿足生理學需要。 結論：仿生細胞外基質-軟骨細胞聚集體是構建特定形態(tài)軟骨的新策略。良