TTMV ORF1基因的克隆表達(dá)及間接ELISA檢測方法的建立.pdf

1、目的：確定上海地區(qū)TTMV的流行毒株，并設(shè)計(jì)特異性引物進(jìn)行原核表達(dá)、純化，最終建立間接ELISA檢測方法，為臨床TTMV的診斷提供理論基礎(chǔ)。
　　方法：采用巢式PCR技術(shù)分別檢測TTMV4個(gè)型的陽性率，利用Mega4.0軟件和DNASTAR進(jìn)行進(jìn)化分析和同源比對，并繪制系統(tǒng)進(jìn)化樹；將TTMV2型ORF1基因在大腸桿菌中進(jìn)行原核表達(dá)，用Ni-NTA柱對表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行純化，采用Western blot檢測并分析結(jié)果，并以此重組蛋白包被E

2、LISA板，通過反應(yīng)條件的優(yōu)化，建立檢測TTMV血清抗體的間接ELISA方法，并利用該方法檢測臨床280份血清樣品。
　　結(jié)果：
　?。?）被檢的176份血液樣品中，TTMV2型感染率最高，達(dá)到14.2％,進(jìn)行同源比對并繪制系統(tǒng)進(jìn)化樹，確定TTMV2型AB038628和AB038626毒株為上海地區(qū)的流行毒株。
　?。?）TTMV2型 ORF1基因在大腸桿菌中以包涵體的形式進(jìn)行了高效表達(dá)，表明該重組蛋白具有良好的反應(yīng)原

3、性，能夠很好的識別TTMV抗體。
　?。?）建立的TTMV間接ELISA檢測方法，經(jīng)重復(fù)性試驗(yàn)、特異性試驗(yàn)和靈敏性試驗(yàn)結(jié)果顯示，該方法具有較好的可重復(fù)性；與TTV、HIV、人星狀病毒和人博卡病毒陽性抗體均無交叉反應(yīng)。
　　結(jié)論：TTMV2型AB038628和AB038626毒株為上海的流行毒株,且2型ORF1基因的原核表達(dá)產(chǎn)物具有良好的反應(yīng)原性，并將該重組蛋白作為抗原包被 ELISA板，建立了檢測TTMV的間接ELISA方法