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文檔簡(jiǎn)介
1、研究背景與目的:
膽管癌是肝膽外科常見的惡性腫瘤之一,近年來該腫瘤發(fā)病率還在不斷上升,尤其是肝內(nèi)膽管癌上升最為明顯。膽管癌的生物學(xué)行為主要是原位浸潤(rùn)生長(zhǎng),黃疸往往是其首發(fā)癥狀,外科切除是最主要的治療方式。但膽管癌常常難以被早期發(fā)現(xiàn),因而治療效果欠佳。如果膽管癌能被早期發(fā)現(xiàn)和診斷,將極大的提高該疾病的治療效果。最近的研究發(fā)現(xiàn),microRNA-21(miR-21)在膽管癌的組織樣本和細(xì)胞系中均表達(dá)上調(diào),且具有較好的診斷敏感性
2、和特異性,可以做為膽管癌的診斷標(biāo)志物。然而microRNA的檢測(cè)并沒有在普通醫(yī)院中得到廣泛開展,因此我們需要進(jìn)一步探索引起miR-21過表達(dá)的相關(guān)調(diào)控因素,以尋找更為合適的診斷標(biāo)志。
砷化物抑制蛋白2(Arsenide inhibition protein 2,Ars2)最初是在倉鼠細(xì)胞抗砷化物中毒的cDNA庫中被篩選出來,科學(xué)界至今對(duì)它的認(rèn)識(shí)還十分有限。許多的線索都提示Ars2可能在microRNA的產(chǎn)生過程和RNA干擾
3、系統(tǒng)的維護(hù)中起著重要作用,而且該蛋白與細(xì)胞增殖能力也有重要關(guān)系。因此,我們猜測(cè)Ars2可能在CCA中表達(dá)增多,并影響miR-21及其下游信號(hào)蛋白的表達(dá)。PTEN和PDCD4這兩個(gè)抑癌基因作為明確的miR-21調(diào)控目的蛋白已在包括膽管癌在內(nèi)的多種腫瘤細(xì)胞中得到了廣泛的研究,它們?cè)趷盒阅[瘤中表達(dá)下降從而影響了腫瘤的增殖侵襲等生物學(xué)行為?;谝陨系难芯勘尘?,在本課題研究中我們希望探討Ars2是否在膽管癌的組織樣本和細(xì)胞系中表達(dá)升高,以及Ars
4、2能否通過miR-21影響其下游抑癌蛋白的表達(dá)進(jìn)而影響膽管癌細(xì)胞的增殖侵襲能力。
材料與方法:
一、組織標(biāo)本與細(xì)胞系:西南醫(yī)院肝膽外科進(jìn)行的膽管癌根治術(shù)中獲取膽管癌及癌旁樣本共18例,患者年齡51~67歲,平均56.78±5.91歲,其中男性11例,女性7例,肝內(nèi)膽管癌和肝外膽管癌各9例。所有患者術(shù)后病理報(bào)告均證實(shí)膽管癌診斷。膽管癌及正常膽管上皮細(xì)胞共3株:QBC939膽管癌細(xì)胞系為西南醫(yī)院肝膽外科自建,來源
5、于肝門部膽管癌患者;RBE肝內(nèi)膽管癌細(xì)胞系購于中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫;HIBEC人類膽管上皮原代培養(yǎng)細(xì)胞購自美國(guó)模式培養(yǎng)物集存庫(American type cadture collection,ATCC)。
一、采用免疫組織化學(xué)染色的方法,同時(shí)檢測(cè)18例膽管細(xì)胞癌及癌旁組織標(biāo)本中Ars2、PTEN、PDCD4三種蛋白的表達(dá),分析它們?cè)谀懝芗?xì)胞癌及癌旁組織中的表達(dá)差異及相互之間的相關(guān)性。
二、利用qRT-PCR和N
6、orthern blots法檢測(cè)樣本中miR-21的表達(dá)。組織和細(xì)胞樣本中Ars2,PTEN和PDCD4的mRNA表達(dá)水平用羅氏公司的qRT-PCR系統(tǒng)檢測(cè)。
三、利用Sigma-Aldrich公司購買的慢病毒包裝的兩個(gè)短發(fā)卡RNA序列shArs2-1,2及不含干擾序列的同種慢病毒作為空載體對(duì)照,轉(zhuǎn)染QBC939和RBE膽管癌細(xì)胞,MTS細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)、裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)、Western blots、qRT-PCR及細(xì)胞免疫熒光法
7、觀察干擾Ars2蛋白表達(dá)后細(xì)胞的增殖、侵襲能力變化及對(duì)下游分子表達(dá)的影響。
四、利用Sigma-Aldrich公司購買的Has-mir-21 mimics以及一個(gè)不能影響人類基因表達(dá)的非人類microRNA作為陰性對(duì)照,按照說明書以100nM的濃度共轉(zhuǎn)染已轉(zhuǎn)染shArs2的QBC939和RBE膽管癌細(xì)胞,觀察外源性過表達(dá)miR-21對(duì)下游分子表達(dá)的影響。
五、利用GeneCopoeia公司半合成法所構(gòu)建的Ar
8、s2全長(zhǎng)序列過表達(dá)及空對(duì)照質(zhì)粒,轉(zhuǎn)染QBC939和HIBEC細(xì)胞,觀察過表達(dá)Ars2對(duì)miR-21、PTEN及PDCD4等下游分子的影響及細(xì)胞增殖能力的變化,并行免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)觀察外源性Ars2質(zhì)粒過表達(dá)的蛋白能否與相關(guān)功能蛋白Drosha酶及CBP-80結(jié)合。
結(jié)果:
一、在18例膽管癌及癌旁樣本中,免疫組化結(jié)果顯示Ars2在膽管癌細(xì)胞中的表達(dá)較癌旁膽管上皮細(xì)胞顯著升高,而PTEN和PDCD4則相反,卡方檢
9、驗(yàn)均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。而在所有膽管癌及癌旁中觀察Ars2與PTEN或PDCD4的表達(dá)情況,卡方檢驗(yàn)結(jié)果其間具有顯著的表達(dá)差異(P<0.01,n=36)。qRT-PCR結(jié)果發(fā)現(xiàn),Ars2 mRNA和miR-21在所有膽管癌樣本中表達(dá)均較癌旁升高(P<0.01,n=18),其中Ars2 mRNA表達(dá)量能夠很好的區(qū)分膽管癌和癌旁組織,敏感性為95%,特異性為100%,ROC曲線下面積為0.995。而PTEN和PDCD4 mRNA的表達(dá)在膽管癌和癌
10、旁間未見顯著差異(PTEN:P=0.937,PDCD4:P=0.653,n=18)。線性回歸分析上述結(jié)果進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)在所有樣本中,Ars2 mRNA的表達(dá)與miR-21的表達(dá)間存在顯著的相關(guān)性(R2=0.469,P<0.001,n=36)。然而上述關(guān)系在Ars2/PTEN/PDCD4和miR-21/PTEN/PDCD4之間均未見存在。以上結(jié)果顯示符合Ars2對(duì)PTEN及PDCD4的調(diào)控是通過miR-21在轉(zhuǎn)錄后水平上的調(diào)控的猜測(cè)。
11、 二、干擾Ars2蛋白表達(dá)后,膽管癌細(xì)胞增殖能力下降,且下降程度與兩個(gè)不同shRNA克隆的干擾能力相一致。Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果也提示轉(zhuǎn)染shArs2-2干擾Ars2后QBC939細(xì)胞的侵襲能力減弱。
三、qRT-PCR和northern blots實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)干擾Ars2表達(dá)后QBC939和RBE膽管癌細(xì)胞中miR-21的表達(dá)下降,Western blots、RT-PCR和免疫熒光實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),PTEN和PDCD4的蛋
12、白表達(dá)升高,它們變化程度均與不同干擾序列的干擾能力相關(guān),而mRNA水平無變化。繼而在干擾Ars2后的細(xì)胞中共轉(zhuǎn)染miR-21 mimics,PTEN和PDCD4的蛋白再次下降,結(jié)果提示干擾Ars2對(duì)PTEN和PDCD4的影響可能是通過miR-21實(shí)現(xiàn)的。
四、QBC939和RBE細(xì)胞轉(zhuǎn)染Ars2全長(zhǎng)序列質(zhì)粒后,western blots檢測(cè)Ars2蛋白表達(dá)升高,但PTEN和PDCD4的表達(dá)無變化,qRT-PCR和north
13、ern blots檢測(cè)miR-21的表達(dá)也無明顯改變。我們進(jìn)一步行免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)的結(jié)果提示,外源性過表達(dá)的Ars2能夠與更多的Drosha蛋白結(jié)合,但不能結(jié)合更多的CBP80,提示單獨(dú)過表達(dá)Ars2可能并不能促進(jìn)膽管癌和膽管上皮細(xì)胞中miR-21的成熟表達(dá)。
結(jié)論:
在本課題的研究中,我們首次發(fā)現(xiàn)了Ars2在膽管癌細(xì)胞中表達(dá)升高,且具有診斷學(xué)意義。Ars2與miR-21在膽管癌細(xì)胞中的表達(dá)之間存在相關(guān)性。在Q
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