GATA6在膽管癌侵襲轉(zhuǎn)移中的作用及分子機(jī)制.pdf

1、一、研究背景
　　膽管癌(Cholangiocarcinoma,CCA)是一種高致死率的消化道惡性實(shí)體腫瘤,侵襲轉(zhuǎn)移是其致死的主要原因。手術(shù)切除能明顯延長(zhǎng)膽管癌病人的生存期,然而很多病人在就診時(shí)即已發(fā)生微轉(zhuǎn)移、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移,使手術(shù)無(wú)法達(dá)到根治的效果;而且很多完成手術(shù)的病人在術(shù)后2年內(nèi)復(fù)發(fā);這些均嚴(yán)重制約手術(shù)效果和病人預(yù)后。因此,研究膽管癌侵襲轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制,為臨床膽管癌病人的治療和預(yù)后分析提供適宜靶點(diǎn)十分必要。
　　

2、GATA6是進(jìn)化保守的GATA轉(zhuǎn)錄因子家族的成員,其在胚胎發(fā)育過(guò)程中主要參與細(xì)胞增殖和分化的調(diào)控。GATA家族包括六個(gè)分子:GATA1/2/3主要表達(dá)于造血系統(tǒng)細(xì)胞,GATA4/5/6主要表達(dá)于中胚層和內(nèi)胚層來(lái)源的組織,如心臟、消化道上皮、肝臟和肺等。近期研究報(bào)道GATA6在惡性實(shí)體瘤中表達(dá)發(fā)生明顯改變,在腫瘤演進(jìn)中發(fā)揮重要調(diào)控作用。而且,GATA6在不同組織來(lái)源的惡性腫瘤中表達(dá)變化情況和生物學(xué)作用明顯不同。在腦星形細(xì)胞瘤、卵巢癌和腎上

3、腺皮質(zhì)腫瘤中GATA6表達(dá)明顯降低,抑制腫瘤增殖,被認(rèn)為是腫瘤抑制因子;相反,GATA6在胰腺癌、結(jié)腸癌和食管癌中的表達(dá)異常增高,促進(jìn)細(xì)胞侵襲,是一個(gè)潛在的癌基因。有些學(xué)者將“GATA6這種在不同組織來(lái)源的惡性腫瘤中表達(dá)變化及作用明顯不同”的模式解釋為“組織來(lái)源特異性”。到目前為止,GATA6在膽管癌中表達(dá)模式目前未見(jiàn)報(bào)道。我們前期體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn):膽管癌細(xì)胞QBC939中GATA6的mRNA表達(dá)顯著高于原代膽管上皮細(xì)胞,提示:膽管癌中GA

4、TA6表達(dá)增加。然而這一結(jié)果需要進(jìn)一步研究證實(shí)。而且,GATA6表達(dá)增加在膽管癌中的作用未知。
　　文獻(xiàn)報(bào)道GATA6能增強(qiáng)一些消化道上皮特異性基因的轉(zhuǎn)錄活性,從而調(diào)控其表達(dá)。67kDa層粘素受體(67kDalamininreceptor,67LR)是一種非整合素受體,表達(dá)于消化道上皮細(xì)胞表面,主要介導(dǎo)細(xì)胞與基底膜及細(xì)胞外基質(zhì)的粘附。研究表達(dá)多種腫瘤中67LR表達(dá)增高,通過(guò)多種機(jī)制促進(jìn)癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移。我們前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)膽管癌中67L

5、R過(guò)表達(dá),顯著促進(jìn)癌細(xì)胞侵襲。惡性腫瘤中67LR過(guò)表達(dá)受轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平的機(jī)制調(diào)控;在轉(zhuǎn)錄水平,研究報(bào)道一些轉(zhuǎn)錄因子能與67LR啟動(dòng)子結(jié)合,調(diào)控其轉(zhuǎn)錄活性。我們前期研究發(fā)現(xiàn):QBC939細(xì)胞中67LR高表達(dá)亞群同時(shí)高表達(dá)GATA6;采用生物信息學(xué)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn):67LR基因啟動(dòng)子區(qū)存在GATA6的結(jié)合位點(diǎn)。因此,我們推測(cè):GATA6可能與67LR啟動(dòng)子結(jié)合,調(diào)控67LR過(guò)表達(dá)。而GATA6可能通過(guò)調(diào)控67LR從而影響膽管癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移。

6、>　　二、研究假說(shuō)
　　綜合既往研究報(bào)道和前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果,我們提出以下研究假說(shuō):膽管癌中GATA6表達(dá)異常改變,與67LR啟動(dòng)子結(jié)合,上調(diào)67LR表達(dá),從而促進(jìn)癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移。本研究旨在闡明GATA6在膽管癌中的作用及相關(guān)機(jī)制,拓寬膽管癌侵襲轉(zhuǎn)移的基礎(chǔ)研究,為臨床膽管癌靶向治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　三、材料方法
　　1.收集本科室2005-2010年間行腫瘤切除術(shù)的87例膽管癌病人的組織標(biāo)本,采用免疫組化實(shí)驗(yàn),對(duì)比癌組織和

7、癌旁組織中GATA6表達(dá)差異;分析GATA6表達(dá)與病人臨床病理特征的相關(guān)性;收集87例膽管癌病人的23例淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶和8例肝轉(zhuǎn)移灶標(biāo)本,對(duì)比轉(zhuǎn)移灶與原發(fā)灶中GATA6的表達(dá)差異。
　　2.收集87例膽管癌病人的隨訪資料(包括術(shù)后存活時(shí)間和無(wú)瘤存活時(shí)間),采用Kaplan-Meier及Cox模型,分析GATA6表達(dá)與病人預(yù)后的關(guān)系。
　　3.構(gòu)建GATA6干擾和過(guò)表達(dá)載體,轉(zhuǎn)染膽管癌細(xì)胞(QBC939和RBE),干預(yù)GATA6

8、表達(dá);通過(guò)損傷修復(fù)實(shí)驗(yàn)、Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)及裸鼠脾種植轉(zhuǎn)移模型,研究干預(yù)GATA6對(duì)膽管癌細(xì)胞遷移、侵襲和轉(zhuǎn)移能力的影響。
　　4.采用免疫組化觀察87例膽管癌組織中67LR的表達(dá)情況,分析67LR和GATA6表達(dá)的相關(guān)性。構(gòu)建GATA6干擾和過(guò)表達(dá)載體,轉(zhuǎn)染膽管癌細(xì)胞(QBC939和RBE);通過(guò)real-timePCR、western-blot和流式檢測(cè)實(shí)驗(yàn),研究膽管癌細(xì)胞中干預(yù)GATA6表達(dá)對(duì)67LR表達(dá)的影響;采用

9、染色質(zhì)免疫共沉淀(ChIP)實(shí)驗(yàn),研究膽管癌細(xì)胞中GATA6能否與67LR基因啟動(dòng)子結(jié)合。
　　四、研究結(jié)果
　　1.87例膽管癌組織中,39例癌組織(45％)呈現(xiàn)GATA6核染色陽(yáng)性;而24例癌旁組織均GATA6核染色陰性;提示膽管癌中存在GATA6異常表達(dá)。分析GATA6表達(dá)與病人臨床病理特性相關(guān)性提示:GATA6陽(yáng)性表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān),而與病人性別、年齡、組織分化程度、原發(fā)灶T分級(jí)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移無(wú)關(guān)。32例淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移

10、灶中,23例(72%)呈現(xiàn)GATA6核染色陽(yáng)性,陽(yáng)性率顯著高于原發(fā)灶(45%);8例肝轉(zhuǎn)移灶中,5例(63%)呈GATA6核染色陽(yáng)性,其陽(yáng)性率也高于原發(fā)灶;這些結(jié)果提示:膽管癌中GATA6異常表達(dá)與腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)。
　　2.Kaplan-Meier分析提示:GATA6陽(yáng)性表達(dá)的病人術(shù)后總存活時(shí)間顯著低于GATA6陰性組病人(log-rankp=0.002);而其腫瘤復(fù)發(fā)顯著早于GATA6陰性表達(dá)的病人(log-rankp=0.0

11、02)。Cox模型分析提示:GATA6異常表達(dá)是判斷病人術(shù)后存活時(shí)間和復(fù)發(fā)的相對(duì)獨(dú)立危險(xiǎn)因素(HR=2.015,95%CI=1.188-3.418,p=0.01;HR=2.132,95%CI=1.271-3.576,p=0.004)。本部分結(jié)果提示:GATA6異常表達(dá)可能是判斷膽管癌病人預(yù)后的潛在分子標(biāo)志。
　　3.QBC939細(xì)胞中GATA6的mRNA和核蛋白表達(dá)水平顯著高于RBE細(xì)胞。QBC939細(xì)胞中,干擾GATA6表達(dá)顯著

12、抑制癌細(xì)胞的侵襲和遷移能力。RBE細(xì)胞中,過(guò)表達(dá)GATA6表達(dá)明顯增強(qiáng)癌細(xì)胞的侵襲和遷移能力。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn):干擾GATA6表達(dá)顯著抑制QBC939細(xì)胞的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移能力。本部分實(shí)驗(yàn)提示:GATA6明顯促進(jìn)膽管癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移。
　　4.87例膽管癌組織中,35例(40%)呈現(xiàn)67LR膜染色陽(yáng)性?？ǚ綑z驗(yàn)提示67LR表達(dá)與GATA6顯著相關(guān)。連續(xù)切片免疫組化發(fā)現(xiàn):67LR和GATA6表達(dá)與膽管癌組織的同一部位。QBC939細(xì)胞中,干擾GA

13、TA6表達(dá)導(dǎo)致67LR的蛋白和mRNA表達(dá)顯著降低;RBE細(xì)胞中,過(guò)表達(dá)GATA6表達(dá)明顯上調(diào)67LR的蛋白和mRNA表達(dá)。流式細(xì)胞檢測(cè)發(fā)現(xiàn):QBC939和RBE細(xì)胞中67LR的膜表達(dá)同樣受67LR調(diào)控。ChIP實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示:QBC939和RBE細(xì)胞中GATA6與67LR基因啟動(dòng)子區(qū)結(jié)合。本部分實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示膽管癌細(xì)胞中GATA6與67LR基因啟動(dòng)子結(jié)合,調(diào)控其表達(dá)。
　　五、研究結(jié)論
　　膽管癌中存在GATA6異常表達(dá),其異