aPKC-ι通過Snail信號通路誘導(dǎo)膽管癌上皮-間質(zhì)細胞轉(zhuǎn)化及免疫抑制.pdf

1、本文分為以下幾個部分進行探討：
　　第一部分 aPKC-ι、Snail表達與免疫細胞浸潤及膽管癌轉(zhuǎn)移和預(yù)后的關(guān)系
　　目的：檢測aPKC-ι、Snail以及免疫細胞表型分子CD4、CD8、CD25、Foxp3在膽管癌組織中的表達，明確aPKC-ι與Snail以及免疫細胞表型間相互關(guān)系，并進一步結(jié)合膽管癌病人臨床資料分析其表達與臨床病理特征的相關(guān)性。
　　方法：在64例膽管癌病人組織標(biāo)本中，利用免疫組化檢測癌組織與癌旁組

2、織中aPKC-ι、Snail以及免疫細胞表型分子CD4、CD8、CD25、Foxp3在mRNA和蛋白質(zhì)水平的差異?？ǚ綑z驗和t檢驗檢測aPKC-ι、Snail以及免疫細胞表型分子 CD4、CD8、CD25、Fo xp3與膽管癌病理分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況和TNM分期的關(guān)系；Spearman相關(guān)性分析法分析aPKC-ι與Snail以及免疫細胞表型分子CD4、CD8、CD25、Foxp3之間相關(guān)性；Kaplan-Meier法分析上述分子表達

3、與膽管癌病人總體生存的關(guān)系；Cox單因素多因素回歸分析膽管癌病人預(yù)后的獨立影響因素。
　　結(jié)果：aPKC-ι、Snail、CD4、CD25和Foxp3在膽管癌組織中顯著高表達，在癌旁組織中低表達；C D8在膽管癌組織中低表達，在癌旁組織中高表達；aPKC-ι和Snail、CD4、CD25、Foxp3在膽管癌組織中協(xié)同高表達，且呈正相關(guān)，并且與 CD8表達相反；aPKC-ι、Snail、CD4、CD8、CD25和Foxp3表達與膽管

4、癌的病理分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期密切相關(guān)；Cox單因素多因素回歸分析提示aPKC-ι、Snail、CD4、CD25和Foxp3是膽管癌預(yù)后的獨立影響因素。
　　結(jié)論：在膽管癌組織內(nèi)，aPKC-ι表達水平與 Snail表達水平呈正相關(guān)，提示aPKC-ι參與癌細胞上皮-間質(zhì)細胞轉(zhuǎn)化；aPKC-ι表達及免疫細胞浸潤程度相關(guān)；aPKC-ι、Snail和免疫細胞協(xié)同促進膽管癌的發(fā)生、發(fā)展和侵襲轉(zhuǎn)移，aPKC-ι、Snail、CD4、

5、CD25和Foxp3是膽管癌預(yù)后的獨立影響因素，可作為預(yù)測膽管癌預(yù)后的指標(biāo)。
　　第二部分 aPKC-ι誘導(dǎo)膽管癌細胞上皮-間質(zhì)細胞轉(zhuǎn)化
　　目的：探討aPKC-ι對人膽管癌細胞上皮-間質(zhì)細胞轉(zhuǎn)化（EMT）的調(diào)控作用。
　　方法：運用小分子技術(shù)構(gòu)建 aPKC-ι-cDNA表達載體，建立穩(wěn)定過表達 aPKC-ι的人膽管癌細胞系，采用WB、IF及qRT-PCR分別從mRNA和蛋白水平檢測aPKC-ι過表達的人膽管癌細胞中上

6、皮樣標(biāo)志物E-cadherin、β-catenin和間質(zhì)樣標(biāo)志物 N-cadherin的表達情況；Transwell侵襲實驗、劃痕試驗檢測膽管癌細胞侵襲能力和遷移能力；CCK8細胞增殖實驗檢測膽管癌細胞增殖能力。通過轉(zhuǎn)染aPKC-ι-siRNA干擾載體入穩(wěn)定過表達aPKC-ι的人膽管癌細胞系，靶向沉默 aPKC-ι的表達，檢測膽管癌細胞 EMT表型標(biāo)志物的表達以及細胞增殖、侵襲和遷移能力的變化，驗證aPKC-ι對膽管癌細胞EMT的調(diào)控作

7、用。通過構(gòu)建裸鼠皮下移植瘤和肺轉(zhuǎn)移模型，體內(nèi)驗證aPKC-ι對膽管癌細胞增殖和轉(zhuǎn)移作用。
　　結(jié)果：在體外，上調(diào)人膽管癌細胞中 aPKC-ι表達，膽管癌細胞上皮樣標(biāo)志物E-cadherin和β-catenin表達減少，而間質(zhì)樣標(biāo)志物N-cadherin表達明顯增多；膽管癌細胞侵襲能力、遷移能力和增殖能力增強；進一步靶向沉默穩(wěn)定過表達aPKC-ι的人膽管癌細胞中aPKC-ι的表達，E-cadherin和β-catenin表達恢復(fù)，N

8、-cadherin表達降低，膽管癌細胞侵襲能力、遷移能力和增殖能力下降。在體內(nèi)，穩(wěn)定過表達aPKC-ι人膽管癌細胞系構(gòu)建的裸鼠成瘤及轉(zhuǎn)移模型中，皮下移植瘤體積明顯增加；肺轉(zhuǎn)移灶數(shù)目亦顯著上升；IH C、WB和qRT-PCR證實該組皮下移植瘤及肺轉(zhuǎn)移灶組織中aPKC-ι表達上調(diào)。
　　結(jié)論：在體內(nèi)外aPKC-ι可誘導(dǎo)膽管癌細胞EMT，進而促進膽管癌侵襲轉(zhuǎn)移。
　　第三部分 aPKC-ι介導(dǎo)的膽管癌細胞EMT誘導(dǎo)免疫抑制

9、　　目的：在第一部分實驗提示aPKC-ι表達與免疫細胞浸潤程度存在相關(guān)性的基礎(chǔ)上，進一步探討aPKC-ι對機體免疫細胞功能的影響及機制。
　　方法：利用aPKC-ι-cDNA表達載體構(gòu)建穩(wěn)定過表達aPKC-ι人膽管癌細胞EMT體外模型，與健康志愿者外周血單個核細胞（PBMCs）共培育5天，CCK8增殖實驗檢測PBMCs增殖；流式細胞術(shù)分析CD4+細胞、CD8+細胞及免疫抑制性 CD4+CD25+細胞的數(shù)量，進一步選定 CD4+細胞

10、、CD4+CD25+細胞和 CD4+CD25-細胞亞群，檢測選定細胞亞群中 Foxp3+細胞的數(shù)量。應(yīng)用免疫磁珠分離共培育體系中CD4+CD25-細胞，與T細胞培育后，CCK8法觀察其對T細胞增殖的影響。轉(zhuǎn)染aPKC-ι-siRNA表達載體入穩(wěn)定過表達aPKC-ι的人膽管癌細胞系，與PBMCs共培育5天，分析免疫抑制性CD4+CD25+/-Foxp3+細胞的數(shù)量。ELISA法檢測不同aPKC-ι表達水平膽管癌細胞系培養(yǎng)液上清中免疫因子I

11、L-2和TGF-β1的表達；并將不同aPKC-ι表達水平膽管癌細胞系培養(yǎng)液上清與 PBMCs共培育，檢測CD4+CD25+/-Foxp3+細胞的數(shù)量；進一步利用Transwell小室分隔的膽管癌細胞與 PBMCs共培育，檢測培養(yǎng)液上清中 IL-2和 TGF-β1的水平以及CD4+CD25+/-Foxp3+細胞的數(shù)目。
　　結(jié)果：穩(wěn)定過表達aPKC-ι人膽管癌細胞系與PBMCs共培育后，PBMCs增殖、CD4+細胞和 C D8+細胞

12、數(shù)量較陰性對照組和空白組明顯下降， CD4+CD25+細胞的數(shù)量無明顯變化；選定的CD4+細胞和CD4+CD25-細胞亞群中，F(xiàn)oxp3+細胞的數(shù)量顯著增加，CD4+CD25+細胞群中，F(xiàn)oxp3+細胞的數(shù)量無明顯改變。實驗組中分離的CD4+細胞抑制T細胞增殖能力顯著增強；轉(zhuǎn)入 aPKC-ι-siRNA的穩(wěn)定過表達 aPKC-ι的人膽管癌細胞系與PBMCs共培育后，CD4+CD25-Foxp3+細胞數(shù)量下降；高表達aPKC-ι的膽管癌細

13、胞培養(yǎng)液上清中IL-2和TGF-β1水平較低表達aPKC-ι的膽管癌細胞培養(yǎng)液上清中明顯增加；將膽管癌細胞培養(yǎng)液上清或利用Transwell小室分隔膽管癌細胞與PBMCs共培育，CD4+CD25-Foxp3+細胞數(shù)明顯增加。
　　結(jié)論： aPKC-ι介導(dǎo)的膽管癌細胞EMT誘導(dǎo)免疫抑制性CD4+CD25-Foxp3+細胞增加，其一部分原因是由于膽管癌細胞分泌的免疫因子 IL-2和 TGF-β1對免疫細胞的影響。
　　第四部分

14、Snail參與 aPKC-ι介導(dǎo)的膽管癌EMT及免疫抑制
　　目的：探討aPKC-ι誘導(dǎo)膽管癌細胞EMT以及免疫抑制的分子機制。
　　方法：WB和qRT-PCR檢測不同aPKC-ι表達水平的人膽管癌細胞系中Snail表達情況；穩(wěn)定過表達aPKC-ι膽管癌細胞中轉(zhuǎn)入Snail-siRNA，WB、IF和qRT-PCR檢測EMT標(biāo)志物表達；CCK8增殖實驗、Transwell侵襲實驗和劃痕試驗觀察靶向沉默Snail對膽管癌細胞增殖

15、和轉(zhuǎn)移作用；構(gòu)建穩(wěn)定低表達aPKC-ι的人膽管癌細胞系，轉(zhuǎn)染Snail-cDNA后檢測EMT標(biāo)志物的表達情況以及膽管癌細胞增殖和轉(zhuǎn)移能力。靶向沉默Snail的穩(wěn)定過表達aPKC-ι膽管癌細胞系與PBMCs共培育5天后，CCK8增殖實驗觀察其對PBMCs增殖的影響，流式細胞術(shù)分析共培育體系中 CD4+細胞、CD8+細胞、CD4+CD25-Fo xp3+細胞數(shù)量變化情況；免疫磁珠分離共培育體系中CD4+CD25-細胞，與T細胞培育后，觀察其

16、對T細胞增殖的影響；ELISA檢測上述膽管癌細胞系培養(yǎng)液上清中IL-2和TGF-β1的表達情況。
　　結(jié)果：人膽管癌細胞系中aPKC-ι表達與Snail呈正相關(guān)；過表達aPKC-ι膽管癌細胞中靶向沉默Snail后，上皮標(biāo)志物表達增加，間質(zhì)標(biāo)志物表達下降，細胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移能力下降。低表達aPKC-ι膽管癌細胞中上調(diào)Snail后，上皮標(biāo)志物表達下調(diào)，間質(zhì)標(biāo)志物表達上升，細胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移能力增加。靶向沉默Snail的穩(wěn)定過表達a

17、PKC-ι膽管癌細胞系與PBMCs共培育5天后， PBMCs增殖增加，CD4+細胞和 CD8+細胞數(shù)目上升、CD4+CD25-Fo xp3+細胞數(shù)量減少；共培育體系中分離的CD4+CD25-細胞抑制 T細胞增殖能力下降；其膽管癌細胞系培養(yǎng)液上清中 IL-2和 TGF-β1的表達顯著下調(diào)。
　　結(jié)論：aPKC-ι通過Snail信號通路調(diào)節(jié)膽管癌EMT并誘導(dǎo)免疫抑制；靶向沉默Snail可以逆轉(zhuǎn)aPKC-ι誘導(dǎo)的上述變化，有望成為膽管癌