澤黃煎劑對實(shí)驗(yàn)性糖尿病大鼠腎損害的治療效應(yīng)與機(jī)制.pdf

1、DM是一種嚴(yán)重威脅人類健康的終身性、全身性疾病，發(fā)病率逐年遞升。 WHO預(yù)測2025 年全世界DM 患者將達(dá)2.99 億，DM 已成為全世界第5 位死亡主因。新增DM 患者主要在中國、非洲等發(fā)展中國家，90％為2 型DM。 DN 是DM 最常見的慢性微血管并發(fā)癥之一，也是終末期腎衰的主要病因，對其進(jìn)行有效防治已成為醫(yī)學(xué)界亟待解決的臨床課題。ZHA 是根據(jù)消渴證“陰虛為本、氣陰兩虛、瘀水內(nèi)停”中醫(yī)病機(jī)，確立以“益氣養(yǎng)陰、化

2、瘀利水”法組方，并結(jié)合多年的臨床實(shí)踐總結(jié)而來的純中藥復(fù)方制劑。臨床觀察證實(shí)，該藥在改善早期DN 患者的水腫、血液流變學(xué)等癥狀、降低FPG、BUN、Scr、Upro 等指標(biāo)有較好療效。為了進(jìn)一步研究ZHA 的臨床效應(yīng)機(jī)制，我們借助于免疫組織化學(xué)法、RT-PCR 法、病理學(xué)等研究手段，探討ZHA 對DN的保護(hù)效應(yīng)及其機(jī)制，為該制劑臨床應(yīng)用、開發(fā)與推廣提供藥理學(xué)證據(jù)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。主要結(jié)果報(bào)告如下： 實(shí)驗(yàn)一ZHA 對DM 大鼠腎組織ECM

3、 的調(diào)節(jié)效應(yīng)與機(jī)制 目的：探討ZHA 對STZ 致DM 大鼠腎損害的保護(hù)機(jī)制及其對ECM 的調(diào)節(jié)作用。 方法：雄性SD 大鼠60 只，隨機(jī)分為正常對照組（正常組）（10 只）和糖尿病造模組（實(shí)驗(yàn)組）（50 只）。正常組喂以常規(guī)飼料，實(shí)驗(yàn)組喂以高糖高脂飼料，4 周后動(dòng)物出現(xiàn)胰島素抵抗，再以小劑量（30mg/kg）STZ 尾靜脈注射以破壞部分胰腺，導(dǎo)致胰島素代償性分泌障礙，建立2 型DM 模型。以空腹血糖>7.8mmol/L

4、，尿糖陽性為造模成功標(biāo)準(zhǔn)，選出成模的30 只動(dòng)物隨機(jī)分為糖尿病腎損害模型組（模型組）、格列吡嗪處理組（對照組）和澤黃煎劑處理組（觀察組），每組各10 只。采用免疫組化法檢測各組大鼠腎組織中的MMP-2、TIMP-1、TGF-β1、COL-Ⅳ和LN、FN 等分布及表達(dá)變化，并測定各組大鼠FPG、FINS、ISI、Scr、BUN、Upro、TG、TC、FFA 等指標(biāo)。 結(jié)果：模型組大鼠早期表現(xiàn)為：多飲、多食、多尿，體重不同程度的有所

5、增加，4 周后一般情況變差，體重下降，消瘦，撓癢，毛發(fā)失去光澤，后期出現(xiàn)腹脹，F(xiàn)PG、Scr、BUN、TG、TC、FFA 及24h Upro 水平明顯高于正常組大鼠（均P<0.05），對照組和觀察組FPG、Scr、BUN、TG、TC、FFA、HbAlc及24h Upro 水平較模型組顯著下降（均P<0.05），其中觀察組與模型組比較下降更明顯（P<0.05）。 正常組大鼠腎小球結(jié)構(gòu)清晰，腎小管上皮細(xì)胞排列整齊，基底膜完整，間質(zhì)中

6、未見炎癥細(xì)胞浸潤、纖維組織增生；模型組腎小球明顯肥大，系膜區(qū)增寬，系膜細(xì)胞增生、基質(zhì)增多，血管壁增厚，球內(nèi)可見大量紅細(xì)胞淤積，腎小管上皮細(xì)胞彌漫性空泡狀變性、腫脹脫落，部分腎小管內(nèi)有蛋白管型淤積；對照組上皮細(xì)胞空泡狀變性呈片狀，腎小球內(nèi)可見紅細(xì)胞淤積的情況，腎小管偶見上皮細(xì)胞脫落，小管內(nèi)可見蛋白管型；觀察組上皮細(xì)胞空泡狀變性呈局灶狀，僅存在于腎被膜下，腎小球內(nèi)少見紅細(xì)胞淤積，腎小管未見上皮細(xì)胞脫落，小管內(nèi)少見蛋白管型。 MMP-

7、2 在正常組腎組織中有明顯的表達(dá)，在腎小球、腎小管及間質(zhì)可見明顯棕黃色強(qiáng)陽性染色區(qū)；模型組MMP-2 僅為弱陽性表達(dá)；TIMP-1 在腎臟主要表達(dá)于腎小球系膜細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞。模型組TIMP-l 的表達(dá)高于正常組(P<0.05)；COL-Ⅳ在正常組腎組織中可見少量棕黃色染色；在模型組，TGF-β1、COL-Ⅳ表達(dá)即明顯增多，在腎小球、腎間質(zhì)中均可見大量棕黃色染色，COL-Ⅳ表達(dá)強(qiáng)陽性。LN、FN 在腎臟成網(wǎng)片狀分布于系膜區(qū)和線狀

8、分布于Bowman’s 囊基底膜上，模型組表達(dá)明顯高于正常組（P<0.05）。 對照組、觀察組MMP-2 較模型組有明顯上升（P<0.05），TIMP-1、TGF-β1、COL-Ⅳ、LN 和FN 有明顯下降（P<0.05），其中FN 下降更加明顯（P<0.01）。 實(shí)驗(yàn)二ZHA對DM大鼠腎組織AQP2表達(dá)的調(diào)節(jié)效應(yīng) 目的：觀測ZHA對DM大鼠腎組織AQP2的調(diào)節(jié)效應(yīng)。 方法：動(dòng)物造模方法同前。AQP2免疫

9、組織化學(xué)檢測：在各組大鼠腎臟中的分布及蛋白質(zhì)的表達(dá)；RT-PCR方法檢測各組大鼠AQP2 mRNA的表達(dá)，并以β-actin相對定量。 結(jié)果：AQP2在腎集合管表達(dá),而在腎小球和腎間質(zhì)未見表達(dá)。模型組大鼠腎臟AQP2蛋白沿集合管內(nèi)壁上皮細(xì)胞分布的棕黃色顆粒比正常組明顯顏色加深而濃厚，分布面積更廣泛。對照組和觀察組AQP2的棕黃色比模型組明顯色度減輕，面積減少（P<0.05）。 RT-PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果顯示：模型組大鼠腎臟

10、AQP2 mRNA的表達(dá)明顯高于正常組，分別為0.81±0.059 和0.51±0.004 ( P < 0.01)。觀察組（0.70±0.027）明顯低于模型組( P < 0.05)。 結(jié)論： 1. ZHA 能降低血糖、血脂，減少24 小時(shí)尿蛋白排泄率，降低尿素氮和血肌酐等指標(biāo)，較好地緩解了動(dòng)物多飲、多食、多尿等癥狀，使動(dòng)物體重穩(wěn)定增加，改善了動(dòng)物的大體狀態(tài)。 2. ZHA 降低DN 大鼠腎組織COL-Ⅳ、LN、

11、FN 的表達(dá)，延緩了腎小球硬化發(fā)展，對腎小球有明顯的保護(hù)作用，這是其防治DN 的效應(yīng)機(jī)制之一。 ZHA 降低ECM 與其調(diào)節(jié)MMP-2、TIMP-1、TGF-β1 的蛋白表達(dá)和活性有關(guān)。 3. DM大鼠腎組織AQP2蛋白和AQP2 mRNA的表達(dá)增高，提示DM腎損害表現(xiàn)的腎組織水腫、細(xì)胞濁脹與腎AQP2表達(dá)的變化相關(guān)。ZHA降低DM大鼠腎組織AQP2蛋白和AQP2 mRNA的表達(dá)，可能是其減輕腎組織水腫的部分機(jī)制。