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文檔簡介
1、目的:1.以寨來昔布和羅格列酮作為對照,通過體外研究觀察黃芪、莪術及黃芪與莪術配伍對MKN-45細胞生長、AKP、LDH及VEGF表達的抑制情況,檢測黃芪與莪術配伍后是否具有增效作用,并觀察各組藥物對MKN-45細胞COX-2、NF-κB、PPARγ表達的影響,探討中藥調(diào)控COX-2表達的作用機制。2.仍以塞來昔布和羅格列酮作為對照,采用組織塊移植法在BALB/c裸鼠體內(nèi)建立原位移植人胃癌模型,觀測黃芪、莪術及黃芪與莪術配伍對人胃癌細胞
2、在BALB/c裸鼠體內(nèi)生長、轉移的影響,分析黃芪與莪術配伍后是否具有協(xié)同增效作用,并檢測各組藥物對人胃癌細胞COX-2、NF-κB、PPARγ表達的影響,從體內(nèi)研究進一步驗證黃芪與莪術配伍調(diào)控通過PPARγ/NF-κB實現(xiàn)對COX-2表達的調(diào)控。 方法:體外研究:體外培養(yǎng)人胃癌細胞MKN-45,取對數(shù)生長期細胞分塞來昔布組、羅格列酮組、黃芪組、莪術組、黃芪與莪術配伍組和空白組,藥物濃度分別為100umol/L、20umol/L、
3、10mg/L、5mg/L、10mg/L,分別在作用24h、48h、72h后收集細胞。用MTT法檢測對細胞的生長抑制率,用分光光度法檢測對細胞內(nèi)LDH、AKP的影響,用ELISA法檢測對VEGF表達的抑制情況。應用RT-PCR法檢測各實驗組COX-2mRNA、NF-κBmRNA、PPARγmRNA表達的變化,western blot方法檢測各組細胞COX-2蛋白表達的變化。體內(nèi)研究:體外培養(yǎng)人胃痛細胞MKN-45,采用組織塊移植法在BAL
4、B/c裸鼠體內(nèi)建立原位移植人胃癌模型,60只裸鼠隨機分為6組:塞來昔布組、羅格列酮組、黃芪組、莪術組、黃芪與莪術配伍組和空白組,于造模后第三天開始灌胃給藥(0.2ml/10g),其中塞來昔布組:90P g·Ng-1·G·1,羅格列酮組:1.8P g·Ng-1·G·1,黃芪組:6.75g·Ng-1·-G·1,莪術組:4.5g·Ng-1·G·1,黃芪、莪術配伍組:11.25 g·Ng·-1·G·1,空白組給予同體積生理鹽水。分別于給藥的第3
5、周和第6周處死裸鼠,用電子天平檢測各組荷瘤裸鼠的體重和瘤塊的重量,比較各組藥物對荷瘤裸鼠體重的影響,計算各組藥物對瘤塊生長的抑制率,并點算第6周各組實驗裸鼠的肝轉移病灶的情況,用免疫組化法檢測瘤塊微血管密度(MVD)的變化,計算各組藥物的對瘤塊微血管密度(MVD)的抑制率。應用RT-PCR法檢測兩個時間段各實驗組COX-2mRNA、NF-κBmRNA、PPARγmRNA表達的變化,以western blot方法檢測各組瘤塊COX-2蛋白
6、表達的變化。 結果:體外研究:各組藥物均能顯著抑制細胞生長,并具有時間依賴性,其中以塞來昔布組的抑制作用最強,配伍組作用其次,并明顯強于單位中藥組。塞來昔布組、羅格列酮組、黃芪組、莪術組、黃芪與莪術配伍組在不同時間的抑制率分別為:24h:11.28%、3.91%、8.27%、8.86%、10.04%;48h:28.07%、15.11%、17.08%、24.57%、26.39%;72h:45.78%、24.9%、28.34%、32
7、.07%、39.68%。各組藥物對細胞分化酶的抑制作用起始于48h,至72h時作用最強,以塞來昔布組和配伍組作用最明顯。各組藥物對VEGF均有顯著抑制作用,總體以塞來昔布組和配伍組作用最強,明顯優(yōu)于其余3組(P<0.05)。各組藥物隨著作用時間的延長,對COX-2mRNA、NF-κBmRNA的表達均有不同程度的下調(diào)作用,以塞來昔布組和配伍組最明顯,莪術組與羅格列酮組接近,除莪術外,各組藥物均能促進PPARγmRNA的表達,以羅格列酮組和
8、配伍組作用最明顯,COX-2蛋白表達的變化與COX-2mRNA基本吻合。體內(nèi)研究:所有藥物中僅黃芪與莪術配伍組在作用6周時的裸鼠體重高于其余各組體重(P<0.01),其余4組藥物組和空白組體重無明顯差異。對瘤塊生長的影響,作用3周時各組藥物均有顯著的抑瘤作用,與空白組相比,除羅格列酮組P<0.05外,其余各組藥物均P<0.01,此時塞來昔布組、羅格列酮組、黃芪組、莪術組、黃芪與莪術配伍組抑瘤率分別為:25.27%、10.45%、13.0
9、0%、13.72%、27.44%。作用6周時各組藥物與空白組相比均P<0.01,此時塞來昔布組、羅格列酮組、黃芪組、莪術組、黃芪與莪術配伍組抑瘤率分別為:37.73%、20.45%、33.64%、26.40%、43.12%。對瘤塊MVD的抑制作用,作用3周時,與空白組相比,塞來昔布組、莪術組和配伍組P<0.01,羅格列酮組和黃芪組P<0.05,此時對MVD的抑制率分別為:41.94%、12.90%、12.90%、25.81%、38.71
10、%。作用6周時各組藥物對MVD的抑制作用與空白組相比均P<0.01,此時對MVD的抑制率分別為:43.75%、18.75%、27.08%、21.88%、50.00%。對肝轉移的影響,實驗第3周未見明顯的肝臟轉移灶,第6周時,給藥組轉移灶均顯著少于空白組,配伍組作用最明顯,優(yōu)于其余任意一組,其余幾組組間無顯著差異。對RT-PCR凝膠電泳產(chǎn)物和蛋白條帶進行灰度分析顯示,對COX-2表達的影響中,塞來昔布組與配伍組能具有顯著抑制作用(與空白組
11、相比P<0.01),且配伍組作用至6周時顯著優(yōu)于塞來昔布組(P<0.05),羅格列酮組作用3周時降低不明顯,但至6周時可以顯著抑制COX-2(P<0.01)。對PPARγ表達的影響中,作用3周時羅格列酮組促表達作用顯著(P<0.01),配伍組P<0.05,作用至6周時,羅格列酮組和配伍組與空白組相比均為P<0.01和P<0.01,此時塞來昔布組亦產(chǎn)生促表達作用(P<0.05)。對NF-κB表達的影響中,作用3周時羅格列酮組和配伍組具有明
12、顯抑制作用(P<0.05),作用至6周時,與空白組相比羅格列酮組和配伍組P<0.01,塞來昔布組、黃芪組、莪術組均P<0.05。 結論:1.黃芪與莪術配伍后對腫瘤細胞生長的抑制具有增效作用。2.COX-2是益氣活血治法的有效作用靶點之一,黃芪與莪術配伍后對COX-2的抑制具有增效作用。3.黃芪與莪術的配伍可能是部分通過PPARγ/NF-κB信號途徑實現(xiàn)對COX-2表達的調(diào)控。4.黃芪與莪術的配伍能更有效的改善荷瘤機體的生存質量、
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