灰樹花深層發(fā)酵條件優(yōu)化及其菌絲體抗腫瘤糖肽的研究.pdf

1、灰樹花[Grifolafrondosa(Dicks.Fr.)S.F.Gray]是近年來開發(fā)比較多的珍奇藥食用菌之一，其多糖和多糖復(fù)合物在抗腫瘤、抗病毒、增強免疫、降血糖、治療糖尿病等多方面的具有明顯的生物活性。本論文在實驗室前期研究工作的基礎(chǔ)上，對灰樹花菌絲體的深層發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化、擴大培養(yǎng)、菌絲體中抑瘤活性物質(zhì)的分離和篩選、組成結(jié)構(gòu)、抑瘤活性物質(zhì)的體內(nèi)外抑癌活性及機理等方面進行了較為深入的研究。 根據(jù)實驗室前期工作所得到的結(jié)論，

2、利用Box-Behnken3×3設(shè)計優(yōu)化了影響灰樹花深層發(fā)酵菌絲體和胞外聚合物的生產(chǎn)的主要培養(yǎng)基組成碳源(葡萄糖)、氮源(蛋白胨)和無機鹽(KH2PO4)。響應(yīng)面分析結(jié)果表明，各因素及其交互作用對響應(yīng)值(灰樹花菌絲體和胞外聚合物產(chǎn)量)均存在顯著的相關(guān)性。通過典型性分析，獲得最大菌絲體(17.61g/l)時培養(yǎng)基組成為：葡萄糖45.2g/L，KH2PO42.97g/L，蛋白胨6.58g/L，MgSO4·7H2O1g/L和玉米漿15g/L；

3、而獲得最大胞外聚合物量(1.326g/L)時的培養(yǎng)基組成為：葡萄糖58.6g/L，KH2PO44.06g/L，蛋白胨3.79g/L，MgSO4·7H2O1g/L和玉米漿15g/L。與其他實驗組的結(jié)果相比，優(yōu)化后的灰樹花菌絲體與胞外聚合物的量都有較大的增加。15L發(fā)酵罐擴大培養(yǎng)的結(jié)果表明，在優(yōu)化培養(yǎng)基組成的條件下，擴大培養(yǎng)后的菌絲體產(chǎn)量最大值達(dá)22.50g/L。 采用15L攪拌式發(fā)酵罐研究灰樹花的擴大培養(yǎng)條件，主要考察了攪拌轉(zhuǎn)速和

4、通氣量對灰樹花菌絲量、胞外聚合物產(chǎn)率、溶氧、菌絲形態(tài)以及發(fā)酵液粘度的影響。研究結(jié)果表明攪拌轉(zhuǎn)速和通氣量能顯著影響灰樹花的生長，并且通過對灰樹花菌絲球的大小、形態(tài)以及胞外聚合物的分泌影響發(fā)酵液的粘度。并得出較為優(yōu)化的培養(yǎng)條件為：溫度25℃，通氣量0.75vvm，攪拌轉(zhuǎn)速100r/min，裝液量60％；在此條件下，發(fā)酵10天后，灰樹花菌絲體最大得率為23.95g/L，胞外聚合物的得率為1.421g/L。 以體外抑制腫瘤細(xì)胞增殖的活性

5、作為篩選導(dǎo)向，采用DEAE-SepharoseFastFlow柱、SephadexG-100柱和AKTA快速分離制備系統(tǒng)對灰樹花發(fā)酵菌絲體的粗提物進行分離純化，從灰樹花深層發(fā)酵培養(yǎng)菌絲體中提取、分離純化得到一種活性酸性糖肽GFPS1b。HPGPC法測得其重均分子量為21kDa。樣品中蛋白含量16.70％，糖含量為86.0％，并含有4.3％的糖醛酸。利用化學(xué)方法(單糖組成分析、部分酸水解、甲基化分析)和光譜方法(GC、GC-MS、紅外吸收

6、光譜、核磁共振)分析GFPS1b的糖鏈結(jié)構(gòu)，結(jié)果表明其單糖組成主要有Glc、Gal、Ara，其糖鏈主鏈由兩個α-D-Glc(1→3)、α-D-Gal(1→4)、α-D-Glc(1→3，6)和α-D-Gal(1→6)組成的，其中葡萄糖基的6位發(fā)生取代，取代側(cè)鏈主要為α-L-Ara-(1→4)-α-D-Glc(1→。該結(jié)構(gòu)與從灰樹花子實體中所提取的多糖D-Fraction以及杜巍等所純化的組分G.F.-2的結(jié)構(gòu)都有很大的不同，因此可以認(rèn)定G

7、FPS1b為一新的糖肽。 通過建立小鼠移植黑色素瘤B16模型，研究了GFPS1b的體內(nèi)抗腫瘤作用。對荷瘤小鼠進行實體瘤稱重，腹腔注射高、中劑量(分別為75mg/kg/d和50mg/kg/d)后，均顯示樣品有顯著的抑瘤效果，其抑瘤率均在30％以上；樣品作用組瘤體積生長速率比陰性對照組慢，且瘤體積??；同時能延長荷瘤小鼠的存活期，增加荷瘤小鼠脾臟的重量及脾指數(shù)，也能一定程度的提高胸腺指數(shù)。HE染色結(jié)果表明GFPS1b中、高劑量組能B1

8、6腫瘤細(xì)胞呈團索狀實性排列或彌漫性分布，并有腫瘤細(xì)胞大片壞死，壞死區(qū)周圍可見凋亡細(xì)胞；免疫組化技術(shù)進一步顯示GFPS1b能誘導(dǎo)瘤組織中Bax基因蛋白表達(dá)，同時也能顯著下調(diào)Bcl-2蛋白的表達(dá)。 研究了GFPS1b體外對SCG-7901的作用的機制。經(jīng)GFPS1b作用后的SGC-7901細(xì)胞在分別經(jīng)光鏡、掃描電鏡和熒光顯微鏡觀察到其形態(tài)特征與對照組相比有明顯差異。光鏡下其細(xì)胞貼壁形態(tài)異常，總細(xì)胞數(shù)量比對照顯著減少；經(jīng)掃描電鏡觀察，

9、細(xì)胞表面的微絨毛在低濃度時部分消失，而在高濃度微絨毛完全消失，細(xì)胞表面光滑，細(xì)胞膜皺縮外突形成小泡；掃描電鏡可觀察到樣品處理的SGC-7901細(xì)胞形成凋亡小體。熒光顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，在高濃度樣品作用下細(xì)胞核均變小、皺縮，可見致密強熒光，而陰性對照組細(xì)胞核所發(fā)熒光均勻彌散。通過PI單染色流式細(xì)胞儀檢測了細(xì)胞周期的變化，發(fā)現(xiàn)GFPS1b作用后的細(xì)胞被阻滯在G2/M期，并且細(xì)胞有較大的凋亡峰(13.4％)，說明樣品能有效地誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，且

10、凋亡細(xì)胞百分率與GFPS1b的劑量成正相關(guān)。DNA電泳結(jié)果表明，GFPS1b作用SGC-7901細(xì)胞48h后，DNA開始發(fā)生斷裂，形成了以200bp左右為最小單位的細(xì)胞凋亡的特征DNA梯帶電泳。以熒光染料PI和Rh123雙重染色樣品作用的細(xì)胞，在高濃度的GFPS1b作用24h和48h后，PI(-)Rh123(-)細(xì)胞增加顯著，并且呈量效關(guān)系，提示GFPS1b可能在不影響細(xì)胞膜完整性的情況下，誘導(dǎo)SGC-7901細(xì)胞線粒體△ψm下降。采用