鼎湖鱗傘菌絲體多糖的發(fā)酵條件優(yōu)化、分離純化、抗腫瘤活性及其機(jī)制的研究.pdf

1、蘑菇作為人類的食物和藥物在世界上已經(jīng)有數(shù)千年的使用歷史了。蘑菇中含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)和醫(yī)藥用途物質(zhì)，包括大量的碳水化合物、蛋白質(zhì)、維生素，硫胺素，核黃素，抗壞血酸，維生素D，以及礦物質(zhì)等。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，蘑菇多糖具有免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗氧化、降膽固醇、降血糖、抗菌和抗病毒、抗過敏和抗炎、保肝護(hù)肝和腸道益生等功能。鼎湖鱗傘(Pholiota dinghuensis Bi)為中國特有種，是Pholiota屬中的一個(gè)新種，1985年發(fā)現(xiàn)于我國

2、廣東省。目前關(guān)于鼎湖鱗傘菌絲體多糖的研究尚未見報(bào)道。因此，本論文主要對(duì)鼎湖鱗傘菌絲體的發(fā)酵條件優(yōu)化、多糖分離純化、理化性質(zhì)研究、體內(nèi)抗CCl4誘導(dǎo)小鼠急性肝損傷、體外抗癌活性篩選、抑制人乳腺癌MCF-7細(xì)胞體外增殖以及誘導(dǎo)其凋亡的信號(hào)通路進(jìn)行了研究。主要研究結(jié)果如下:
　　 1.液體發(fā)酵制備鼎湖鱗傘菌絲體粗多糖的條件優(yōu)化首先通過單因素試驗(yàn)篩選了發(fā)酵產(chǎn)生鼎湖鱗傘菌絲體多糖的培養(yǎng)基成分以及發(fā)酵條件。初步確定了適于鼎湖鱗傘菌絲體多糖的

3、最佳培養(yǎng)基配方為復(fù)合碳源(葡萄糖和玉米粉)40 g/L、復(fù)合氮源（蛋白胨和酵母膏）4g/L、KH2PO41 g/L和MgSO41.5 g/L，最佳的接種量為15％(v/v)，培養(yǎng)溫度為25℃，搖床轉(zhuǎn)速為140 rpm。
　　 然后在單因素優(yōu)化基礎(chǔ)上采用部分組成因子設(shè)計(jì)(FFD)試驗(yàn)研究了不同培養(yǎng)基成分對(duì)鼎湖鱗傘菌絲體多糖的顯著性影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，葡萄糖、玉米粉和酵母膏對(duì)鼎湖鱗傘菌絲體多糖的產(chǎn)量最為顯著。進(jìn)一步采用爬坡試驗(yàn)得到葡萄糖

4、、玉米粉和酵母膏濃度中心點(diǎn)分別為35、10和5 g/L。并以此為中心點(diǎn)，采用中心組成因子設(shè)計(jì)(CCD)試驗(yàn)對(duì)顯著性影響因素的濃度進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明，當(dāng)葡萄糖、玉米粉和酵母膏的濃度分別為36.0、11.8和5.4 g/L時(shí)，鼎湖鱗傘菌絲體多糖產(chǎn)量達(dá)到757±38 mg/L，與預(yù)測(cè)值較為一致。統(tǒng)計(jì)分析表明該模型能有效的預(yù)測(cè)鼎湖鱗傘菌絲體多糖的產(chǎn)量。
　　 液體發(fā)酵得到的菌絲體經(jīng)干燥、粉碎、熱水浸提、乙醇沉淀、離心，然后用丙酮和乙醚依

5、次洗滌、干燥，得到鼎湖鱗傘菌絲體粗多糖。
　　 2.鼎湖鱗傘菌絲體多糖分離純化與理化性質(zhì)研究采用DEAE-纖維素陰離子交換柱層析法對(duì)鼎湖鱗傘菌絲體粗多糖進(jìn)行初步分離，并采用葡聚糖G-100凝膠過濾柱層析法對(duì)各個(gè)組分進(jìn)一步純化，得到鼎湖鱗傘菌絲體多糖純化組分PDP-1、PDP-2和PDP-3共三個(gè)組分，得率分別為60.25％、23.69％和4.61％。采用分子排阻液相法進(jìn)一步分析了PDP-1、PDP-2和PDP-3，結(jié)果發(fā)現(xiàn)三種純

6、化多糖是均一的組分，分子量分別為1.59×105、7.20×105和3.53×105 Da。
　　 采用苯酚-硫酸法、間羥聯(lián)苯法、考馬斯亮藍(lán)法和氯化鋇-明膠比色法測(cè)定了多糖樣品中的總糖、糖醛酸、蛋白質(zhì)和硫酸基含量，結(jié)果表明鼎湖鱗傘菌絲體粗多糖、PDP-1、PDP-2和PDP-3中總糖含量分別為86.95％、97.97％、94.46％和85.58％;在所測(cè)的各個(gè)多糖組分中，PDP-3含有較高的蛋白、糖醛酸和硫酸基含量。
　　

7、 通過糖腈乙酸酯衍生物氣相色譜法測(cè)定了多糖樣品的單糖組成。鼎湖鱗傘菌絲體粗多糖、PDP-1、PDP-2和PDP-3中的葡萄糖含量分別為92.54％、92.24％、88.65％和67.83％。對(duì)于粗多糖而言，阿拉伯糖、巖藻糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖的比例分別為2.18％、1.06％、1.48％、0.92％、92.54％和1.82％。三個(gè)純化組分中，與PDP-1和PDP-2相比，PDP-3的單糖組成更為復(fù)雜，其中PDP-3中含有鼠李

8、糖和木糖，而PDP-1和PDP-2沒有被檢測(cè)到，且PDP-3中的巖藻糖、甘露糖和半乳糖含量均比PDP-1和PDP-2中的含量高。
　　 紅外光譜掃描結(jié)果顯示，鼎湖鱗傘菌絲體粗多糖以及各個(gè)純化樣品的吸收峰表明了所有樣品均具有多糖特征。圖譜中特征吸收峰表明PDP-2和PDP-3是酸性多糖和硫酸酯化多糖;同時(shí)證明了PDP-3可能是一種多糖和蛋白或肽的復(fù)合物。紫外光譜掃描結(jié)果表明鼎湖鱗傘菌絲體粗多糖及其各純化組分在波長為280 nm左右

9、有不同程度的吸收峰，表明各樣品均含有一定的蛋白或者肽，但是PDP-3的蛋白比其它組分含量更高。
　　 3.鼎湖鱗傘菌絲體粗多糖體內(nèi)對(duì)CCl4誘導(dǎo)小鼠急性肝損傷的肝保護(hù)作用采用四氯化碳誘導(dǎo)的小鼠急性肝損體內(nèi)動(dòng)物試驗(yàn)?zāi)Ｐ驮u(píng)價(jià)了鼎湖鱗傘菌絲體粗多糖肝保護(hù)作用。結(jié)果表明，鼎湖鱗傘菌絲體粗多糖能有效降低小鼠血清中的天門冬氨酸轉(zhuǎn)移酶(AST)和丙氨酸轉(zhuǎn)移酶(ALT)活性，并提高小鼠肝臟組織中SOD和GSH-Px的活性;同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)，鼎湖鱗傘

10、菌絲體粗多糖能抑制四氯化碳誘導(dǎo)的小鼠肝組織中丙二醛(MDA)的含量;小鼠肝組織切染色結(jié)果顯示高劑量鼎湖鱗傘菌絲體粗多糖（每天200 mg/kg體重）能明顯減輕四氯化碳導(dǎo)致的小鼠肝臟組織浸染、細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)和顏色變化，達(dá)到陽性對(duì)照的保肝護(hù)肝效果。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明鼎湖鱗傘菌絲體粗多糖對(duì)四氯化碳誘導(dǎo)的小鼠急性肝損有明顯的保護(hù)作用。
　　 4.鼎湖鱗傘菌絲體粗多糖及其純化組分體外抑制腫瘤細(xì)胞增殖活性與機(jī)理采用MTT法以人胃癌BGC-823細(xì)胞

11、為模型，同時(shí)采用亞甲基藍(lán)染色法以人肝癌HepG2細(xì)胞為模型，分別篩選了鼎湖鱗傘菌絲體粗多糖及其純化組分(PDP-1、PDP-2和PDP-3)的體外腫瘤細(xì)胞增殖抑制活性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PDP-3具有較好的體外抗腫瘤細(xì)胞增殖的活性。然后，以人乳腺M(fèi)CF-10A細(xì)胞、人乳腺癌MDA-MB-231和MCF-7細(xì)胞株篩選了PDP-3體外對(duì)人乳腺細(xì)胞的增殖抑制活性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)PDP-3對(duì)于非腫瘤化的人乳腺M(fèi)CF-10A細(xì)胞沒有明顯增殖抑制作用，而對(duì)人乳腺

12、癌MDA-MB-231和MCF-7細(xì)胞均具有非常顯著增殖抑制作用;細(xì)胞劃痕愈合試驗(yàn)結(jié)果表明PDP-3能有效降低MDA-MB-231細(xì)胞的浸染和轉(zhuǎn)移能力。Western-blot試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PDP-3能顯著增加雌性激素依賴型的人乳腺癌MCF-7細(xì)胞中p21蛋白表達(dá)，同時(shí)能明顯降低PCNA、Cyclin D1和CDK4的蛋白表達(dá)。
　　 5.PDP-3體外誘導(dǎo)人乳腺癌MCF-7凋亡及其抗癌機(jī)理采用Western-blot法測(cè)定了P

13、DP-3處理對(duì)人乳腺癌MCF-7細(xì)胞中的Bcl-2、Bax、Caspase-9、Caspase-3、p-p53、p-p38、ASK1、TRAF2以及細(xì)胞核和細(xì)胞之中的ER-α等蛋白的表達(dá)影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PDP-3處理激活了人乳腺癌MCF-7細(xì)胞中p38/MAPK通路，通過提高p21蛋白表達(dá)，降低人乳腺癌MCF-7細(xì)胞中與細(xì)胞增殖(PCNA)和細(xì)胞周期相關(guān)蛋白（Cyclin D1和CDK4）表達(dá)，從而有效抑制了細(xì)胞增殖;同時(shí)通過增加Bax

14、和降低Bcl-2表達(dá)，以及激活Caspase家族蛋白（Caspase-9和Caspase-3）共同誘導(dǎo)人乳腺癌MCF-7細(xì)胞凋亡。上游蛋白表達(dá)結(jié)果證實(shí)PDP-3提高了p-p53、p-p38和ASK1蛋白表達(dá)，并降低TRAF2蛋白表達(dá);同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)，PDP-3處理能顯著降低了人乳腺癌MCF-7細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中雌激素受體ER-α蛋白的表達(dá)。TUNEL試驗(yàn)和DNA片段化試驗(yàn)結(jié)果分別證實(shí)了PDP-3能誘導(dǎo)人乳腺癌MCF-7細(xì)胞凋亡。結(jié)合本論文第