葉脈發(fā)育相關(guān)基因CkERF2和CkCOV1在檸條葉脈響應(yīng)干旱中的表達(dá)研究.pdf

1、檸條集中分布在我國干旱和半干旱地區(qū)，在形態(tài)、生理和分子水平均對(duì)干旱做出適應(yīng)性響應(yīng)。目前對(duì)其形態(tài)和生理水平的干旱適應(yīng)性特征已有較多報(bào)道，但分子水平的抗旱研究還處于起步階段。本研究針對(duì)檸條在干旱加劇條件下葉柄維管束和葉脈更加發(fā)達(dá)的形態(tài)特征，從分子水平探究葉脈分化發(fā)育關(guān)鍵基因CkERF2和CkCOV1在檸條維管組織中的功能，為擴(kuò)展深化檸條維管組織響應(yīng)干旱的分子機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　論文獲得如下結(jié)果:
　　(1)從檸條葉樣中提取總

2、RNA，反轉(zhuǎn)錄獲得第一鏈cDNA，通過RT-PCR的方法克隆CkERF2基因，經(jīng)測(cè)序表明:克隆得到轉(zhuǎn)錄因子CkERF2序列756bp，編碼252個(gè)氨基酸，通過NCBI在線數(shù)據(jù)庫Blastn比對(duì)表明不同物種間該基因的同源性較高，并且所含的AP2結(jié)構(gòu)域三維結(jié)構(gòu)與擬南芥中的一致。
　　(2)采用BL21大腸桿菌原核表達(dá)的方法產(chǎn)生融合蛋白，純化后作為免疫原，免疫實(shí)驗(yàn)用兔，獲得CkERF2兔源多克隆抗體，經(jīng)Western Blotting實(shí)

3、驗(yàn)檢驗(yàn)多克隆抗體的特異性，結(jié)果表明，獲得的多克隆抗體可以特異性的與原核表達(dá)蛋白發(fā)生免疫反應(yīng)，并且原核表達(dá)蛋白大小以外的區(qū)域檢測(cè)不到信號(hào)。說明成功克隆到特異性較高的多克隆一抗。
　　(3)以自然干旱梯度上的檸條葉樣為試驗(yàn)材料，通過qRT-PCR和Western Blotting技術(shù)，分別從轉(zhuǎn)錄水平和翻譯水平檢測(cè)CkERF2及其蛋白的相對(duì)表達(dá)量，結(jié)果表明隨著干旱脅迫的加劇，檸條葉樣中CkERF2及其蛋白表達(dá)量均呈現(xiàn)上升趨勢(shì)。說明干旱脅

4、迫時(shí)，檸條CkERF2在基因水平和蛋白水平均做出響應(yīng)。
　　(4)利用pCAMBIA1302載體中的GFP綠色熒光蛋白，構(gòu)建重組載體pCAMBIA1302-CkERF2，使CkERF2和GFP綠色熒光蛋白融合表達(dá)，瞬時(shí)轉(zhuǎn)化30d苗齡的本氏煙草，橫切和縱切煙草葉片主脈，熒光顯微鏡下觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果，CkERF2蛋白定位于維管組織木質(zhì)部中，推測(cè)CkERF2可能在調(diào)控原形成層細(xì)胞向木質(zhì)部分化的過程中扮演重要角色。
　　(5)構(gòu)建pGB

5、KT7-CkERF2重組載體，將pGBKT7-CkERF2重組載體和pGADT7空載體轉(zhuǎn)化至酵母菌感受態(tài)細(xì)胞中，涂布在營養(yǎng)缺陷固體培養(yǎng)基上，觀察菌落生長(zhǎng)狀況。酵母自激活實(shí)驗(yàn)表明轉(zhuǎn)化有pGBKT7-CkERF2和pGADT7載體的酵母菌，在三缺和四缺培養(yǎng)基上均能很好生長(zhǎng)，并且在含有X-gal的四缺培養(yǎng)基中可以發(fā)生顏色反應(yīng)，說明CkERF2具有轉(zhuǎn)錄自激活活性，為后續(xù)尋找CkERF2的互作蛋白提供試驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　(6)同克隆CkERF2

6、相同的方法，從檸條葉樣中克隆得到CkCOV1基因長(zhǎng)為946bp的序列，其中開放閱讀框?yàn)?77bp，編碼258個(gè)氨基酸，推測(cè)該蛋白分子量為28.84KD，等電點(diǎn)為5.46，是一種疏水蛋白，并用生物信息學(xué)軟件MEGA5構(gòu)建聚類樹分析該基因的親緣關(guān)系;最后利用qRT-PCR方法進(jìn)行檸條干旱脅迫下葉樣該基因表達(dá)水平的定量分析。隨著干旱的加劇，該基因在檸條葉樣中的表達(dá)量呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。表明檸條CkCOV1基因的下調(diào)表達(dá)與維管系統(tǒng)積極響應(yīng)干旱有關(guān)。<