谷子在干旱逆境中差異表達基因的分離與表達譜分析.pdf

1、谷子(Setaria italica(L．)Beauv)起源于我國的黃河流域，在中國種植已有7000年的歷史，是世界上栽培歷史最悠久的作物之一。谷子耐旱能力強、水分利用效率高，適于在我國干旱少雨的地區(qū)播種。目前有關谷子抗旱性分子機制和從谷子中發(fā)掘抗旱基因的研究幾乎是空白。為了發(fā)掘谷子中的抗旱基因，我們首次利用抑制性差減雜交法構建了谷子干旱誘導表達差減文庫和干旱抑制表達差減文庫，并采用cDNA microarray技術分析了差減文庫的表達

2、譜，篩選獲得了很多有意義的差異表達片段。文章并報道克隆到一個在谷子根中被干旱逆境特異誘導表達的基因12氧代植二烯酸還原酶(SiOPRl)，并對該基因的表達特性進行了詳細的分析。 實驗首先從魯7060、羊角黃、豫谷5號、Jun 24和Mar51五個谷子品種中通過苗期快速鑒定選出一個較抗旱品種Mar 51。以品種MaLr 51為研究材料，應用20％的PEG6000處理谷子幼苗根系模擬自然干旱逆境，利用抑制性差減雜交法同時構建了干旱誘

3、導表達差減文庫(正庫)和抑制表達差減文庫(反庫)。正庫共挑菌2112個，反庫共挑菌1372個，并全部送去測序。序列經過去載體和去接頭后，拼接在一起，最后正庫共獲得414個Contigs和745個Singletons，合計1159個UniESTs。反庫共獲得136個Contigs和1804個Singletons，合計940個UniESTs。同時出現在正庫和反庫中的序列數為150個，合并正庫和反庫在一起共獲得1949個谷子LlniESTs。

4、測序出現低的冗余度表明構建差減文庫的均一化水平和差減效率都很高。將1949個谷子UniESTs按照MIPS進行功能分類，共包含21個大類，占有比例最高的一類是代謝相關基因，其次是轉錄相關的基因，再次是參與蛋白質合成與降解、參與細胞命運、細胞信號轉導和能量代謝等生物學過程的基因。 為了驗證差減文庫和篩除假陽性克隆，我們將獲得的1949個UniESTs點制了cDNA芯片，利用cDNA micromTaV技術對差減文庫進行了鑒定和表達

5、譜分析。結果表明，受干旱逆境誘導表達的ESTs在根中共獲得93個，在地上部中共獲得52個。受干旱逆境抑制表達的ESTs在根和地上部中分別獲得10和27個。在根和地上部中被干旱逆境共同誘導表達的ESTs僅有5個，共同抑制表達的沒有出現。采用Northem blot雜交實驗進一步驗證了cDNA microarray的結果，在挑選的10個表達模式不同的ESTs中，Northem blot雜交結果都很好地與cDNA microarray實驗的結

6、果相互印證，有力地說明了cDNA microarray實驗結果的可靠性。 谷子幼苗在干旱逆境下的基因表達譜分析表明，在根和地上部中分別由不同類別的基因參與響應干旱逆境，表現出不同的分子機制。在干旱逆境下谷子中很多基因是被抑制表達的，因此我們提出負調控在谷子適應干旱逆境反應中起著重要的作用。一個很有趣的結果是，在谷子根系早期誘導表達的基因多數是參與糖代謝途徑(包括糖酵解、三羧酸循環(huán)、和糖異生途徑)的酶，說明谷子根系在最早期的適應性

7、反應是基本能量代謝被激活。此外，發(fā)現蛋白質降解和修復在谷子干旱適應性分子機制中也具有很重要的調控作用。 為了分析ABA和茉莉酸甲酯(MeJA)兩種植物激素在谷子適應干旱逆境中的作用，采用同樣的芯片，分析了ABA和MeJA處理對谷子基因表達的影響。結果顯示，被ABA誘導表達的ESTs在根和地上部中分別有72和135個，被ABA抑制表達的ESTs在根和地上部中分別有123和18個。同時在根和地上部中被ABA誘導表達的ESTs僅有2個

8、，抑制表達的僅有6個。在MeJA處理中，在根和地上部中被誘導表達的ESTs分別有78和10個，在根和地上部中被抑制表達的ESTs分別有17和122個。同時在根和地上部中被MeJA誘導表達的EST只有1個，抑制表達的也是1個。聚類分析PEG、ABA和MeJA作用下的基因表達譜發(fā)現，PEG處理下的基因表達模式在根中與MeJA更為接近，在地上部中與ABA更為接近。分別比較PEG與ABA、PEG與MeJA之間基因表達的重疊圖發(fā)現，重疊基因的數目

9、并不是太多，因此認為在谷子適應干旱逆境的調控途徑中，除ABA和MeJA調控途徑之外還包括其它的途徑。 從干旱誘導表達EST中，挑選出兩個受PEG強烈誘導的ESL，發(fā)現編碼同一個基因的產物12氧代植二烯酸還原酶。根據這兩個EST片段的已知序列，利用RACE技術首次從谷子中克隆獲得12氧代植二烯酸還原酶基因的全長cDNA序列，命名為SiOPRl。SiOPRl基因全長共1360bp，編碼374aa，預測分子量為41.9kDa，等電點為

10、5.14。在氨基酸水平上，SiOPRl基因編碼的蛋白質在禾谷類作物的不同物種之間保守性很高。不同逆境因子(包括PEG、ABA、NaCI和MeJA)處理的表達譜分析結果表明，SiOPRl基因只被干旱逆境處理特異地誘導表達，而且誘導部位只限制在根中，在地上部不受誘導。ABA、NaCl和MeJA處理對SiOPRl基因的表達都沒有影響。不同組織部位的Northem雜交結果顯示，SiOPR基因的表達水平都很低，檢測沒有雜交信號。SiOPR基因在谷