檸條錦雞兒響應(yīng)干旱的miRNA表達(dá)譜分析及Cko-miR2119與靶基因克隆鑒定.pdf

1、干旱導(dǎo)致我國荒漠化和沙化土地總面積占國土面積的近45％。檸條作為防風(fēng)固沙的優(yōu)勢物種，近年來從生態(tài)價值、生理特征及形態(tài)解剖等方面進(jìn)行的抗旱機(jī)制研究較多，而在分子水平的機(jī)制闡釋較少，從miRNA調(diào)控入手對干旱響應(yīng)的解釋更少。本研究應(yīng)用高通量測序技術(shù)對自然降水梯度下的三個檸條分布區(qū)的檸條葉樣進(jìn)行miRNA測序，預(yù)測與檸條抗旱相關(guān)的miRNAs，結(jié)合miRNA調(diào)控的靶基因?qū)帡l的干旱適應(yīng)機(jī)制進(jìn)行研究。同時為排除其他非生物脅迫的干擾，筆者設(shè)計室內(nèi)

2、單因素控水實(shí)驗(yàn)，將檸條分別置于土壤相對含水量為75％，55％和35％三個不同的水分梯度下模擬野外干旱脅迫。通過檢測野外樣品和室內(nèi)控水實(shí)驗(yàn)樣品中與干旱響應(yīng)有關(guān)的miRNA和靶基因的表達(dá)，為闡明檸條抗旱的分子機(jī)制擴(kuò)充有關(guān)miRNAs調(diào)控靶基因響應(yīng)干旱機(jī)理的內(nèi)容。
　　論文主要結(jié)果如下:
　　(1)野外選取黃土高原降水依次減少的三個試驗(yàn)點(diǎn)（黃陵、榆林和達(dá)拉特旗）檸條葉片進(jìn)行miRNA轉(zhuǎn)錄組測序。三個樣品分別獲得了13，710，68

3、1，15，048，945和15，198，442條reads。共鑒定獲得490個已報道的miRNAs，預(yù)測96個未報道的新miRNAs。
　　(2)對已鑒定和預(yù)測的586個miRNA進(jìn)行GO功能富集分析和KEGG通路顯著性富集分析，獲得39個可能與水分脅迫應(yīng)答相關(guān)的miRNA。利用stem loop qPCR分析驗(yàn)證了miRNA高通量測序預(yù)測的9個差異表達(dá)miRNAs(miR390，miR394，miR398，miR529，miR5

4、30，miR2119，miR5232，miR5559，miR5770)，結(jié)果表明9個miRNAs的差異表達(dá)趨勢與測序預(yù)測數(shù)據(jù)一致。
　　(3)對響應(yīng)干旱較為關(guān)鍵的5個miRNA(miR390，miR398，miR530，miR2119，miR5559)，室內(nèi)設(shè)計三個水分梯度(75％，55％，35％)模擬野外干旱脅迫進(jìn)行驗(yàn)證。利用qPCR同時對野外和室內(nèi)檸條樣品miRNA表達(dá)進(jìn)行定量分析，結(jié)果表明這5個miRNA對自然干旱和室內(nèi)干旱

5、梯度具有相同的響應(yīng)趨勢，即隨干旱加劇檸條miRNA表達(dá)量均呈下調(diào)趨勢。
　　(4)進(jìn)而對其中2個鮮有報道的miRNA（miR2119和miR5559）預(yù)測的靶基因進(jìn)行定量分析，野外和室內(nèi)結(jié)果表明隨水分脅迫的加劇這2個miRNAs的表達(dá)量降低，而各自2個靶基因卻呈現(xiàn)上調(diào)趨勢。相關(guān)性分析表明:miR2119與靶基因BI-1和CAP的表達(dá)趨勢相關(guān)性R2達(dá)到了0.942和0.852;miR5559與靶基因HIRA和SEO的表達(dá)趨勢相關(guān)性R

6、2分別達(dá)到了0.960和0.966。
　　(5)進(jìn)一步克隆miR2119和靶基因BI-1和CAP。構(gòu)建pCMBIA-1304-amiR2119、pCMBIA-1304-BI-1和pCMBIA-1304-CAP載體，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的煙草葉片瞬時轉(zhuǎn)染法證實(shí)miR2119與靶基因BI-1和CAP存在互作。利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的煙草遺傳轉(zhuǎn)化法，獲得轉(zhuǎn)miR2119、BI-1和CAP基因的煙草轉(zhuǎn)基因系。
　　綜合上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果得出結(jié)論:證實(shí)高