基于芯片表達(dá)干旱響應(yīng)差異基因的克隆和功能初步鑒定.pdf

1、干旱是影響植物生長(zhǎng)發(fā)育的主要非生物脅迫因子,也是制約我國(guó)農(nóng)業(yè)發(fā)展的主要因素之一,據(jù)統(tǒng)計(jì)干旱給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成的損失幾乎是其它自然災(zāi)害所造成損失的總和。通過(guò)分子育種提高作物耐旱性獲得抗旱材料是當(dāng)前人類面臨的重大課題。番茄(Solanum lycopersicum)是一種世界種植的蔬菜,培育抗旱番茄品種具有重要意義。同時(shí),番茄又是一種模式植物,基礎(chǔ)研究比較深入,遺傳轉(zhuǎn)化體系已經(jīng)成熟,便于進(jìn)行基因功能的驗(yàn)證。本實(shí)驗(yàn)室利用抗旱性野生番茄品種S.pe

2、nnellii創(chuàng)制的漸滲系群體中篩選出的耐旱系及其干旱敏感的受體品種M82為材料,與番茄Oligo cDNA芯片雜交,獲得大量干旱響應(yīng)上調(diào)和下調(diào)表達(dá)基因。本研究利用芯片從中篩選出干旱脅迫前后表達(dá)量差異較大的基因作為候選基因,構(gòu)建超量表達(dá)載體,并通過(guò)遺傳轉(zhuǎn)化將目的基因?qū)腚p子葉植物中,獲得轉(zhuǎn)基因植株,應(yīng)用不同濃度的PEG進(jìn)行模擬干旱處理,對(duì)基因功能進(jìn)行初步驗(yàn)證,為下一步系統(tǒng)分析基因的生物學(xué)功能及其作用的分子機(jī)理奠定了基礎(chǔ)。本研究獲得的主要

3、結(jié)果有:
　　 1.芯片結(jié)果顯示,在干旱脅迫處理后,SpPRP基因、SpPRPP基因和SpCTF2A基因的表達(dá)量分別增加了11.1倍、22.6倍和18.1倍。本研究選取SpPRP基因和SpPRPP基因這兩個(gè)基因作為候選基因,通過(guò)芯片結(jié)果得到候選基因的EST序列,應(yīng)用生物信息學(xué)分析,得到全長(zhǎng)cDNA序列,設(shè)計(jì)引物,克隆得到兩個(gè)候選基因的全長(zhǎng)cDNA。測(cè)序結(jié)果表明SpPRPP基因全長(zhǎng)789bp,完整的讀碼框共編碼261個(gè)氨基酸;Sp

4、PRP基因全長(zhǎng)981bp,完整的讀碼框共編碼325個(gè)氨基酸。通過(guò)氨基酸比對(duì)結(jié)果表明,這兩個(gè)基因與其他植物的同類基因也具有較高的同源性。
　　 2.提取S.pennellii和M82不同組織部位的RNA,半定量RT-PCR,分析發(fā)現(xiàn)3個(gè)基因在S.pennellii和M82中都具有明顯的組織表達(dá)特異性。SpCTF2A基因在S.pennellii和M82的不同組織部位均有表達(dá),其中在S.pennellii的莖葉花中表達(dá)量較高,在M82

5、的莖花果中表達(dá)量較高。SpPRP基因在M82的根和花中表達(dá)量較高,SpPRPP基因在M82的莖和花中表達(dá)量較高,SpPRP和SpPRPP基因在S.pennellii的葉花中表達(dá)量較高,且這兩個(gè)基因在花中的表達(dá)量均最高。
　　 3.提取M82在鹽、高溫和冷脅迫不同逆境處理以及Ethy,SA,ABA和JA不同激素處理下的RNA,半定量RT-PCR分析。發(fā)現(xiàn)基因SpCTF2A在三種脅迫處理下表達(dá)量與對(duì)照相比均有明顯增加,且對(duì)SA、JA

6、和ABA處理均發(fā)生響應(yīng),但是在Ethy處理下表達(dá)量沒(méi)有明顯變化；SpPRPP基因在鹽處理和冷處理下表達(dá)量增加,在高溫處理下表達(dá)量有少量降低,在激素處理下只在ABA和SA誘導(dǎo)下表達(dá)量顯著升高；SpPRP基因在三種逆境脅迫下表達(dá)量都明顯上升,在激素處理下對(duì)Ethy和SA發(fā)生快速響應(yīng)。
　　 4.分別構(gòu)建了SpPRP基因和SpPRP基因的超量表達(dá)載體；利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法將SpPRP基因,SpPRPP基因和SpCTF2A基因的

7、超量表達(dá)載體成功導(dǎo)入番茄品種ZS5、AC和M82,及煙草(Nicotiana tabacum)品種K326中。
　　 5.番茄遺傳轉(zhuǎn)化共獲得卡那霉素抗性植株84株,其中轉(zhuǎn)SpPRP基因共19株,轉(zhuǎn)SpPRPP基因共35株,轉(zhuǎn)SpCTF2A基因共30株；煙草卡那霉素抗性植株50株,其中轉(zhuǎn)SpPRP基因共有15株,轉(zhuǎn)SpCTF2A基因共35株。PCR檢測(cè)結(jié)果初步表明,外源基因已整合到番茄基因組中。
　　 6.利用8％的PEG