小麥TaCBLs和TaCIPKs基因克隆與互作分析.pdf

1、Ca2+作為植物中普遍存在的第二信使，其信號傳感器類鈣調磷酸酶B蛋白(CBL，Calcineurin B-like protein)及其互作蛋白激酶CIPK(CBL-interacting protein kinase)構成了Ca2+-CBL-CIPK網絡信號通路，在植物的生長發(fā)育和逆境脅迫響應過程中發(fā)揮著重要作用。CBL蛋白家族擁有四個保守性不同的EF手型結構，每個EF結構由12個氨基酸組成，通過loop環(huán)結合Ca2+。CIPK蛋白的

2、N端激酶區(qū)域DFG和APE結構域之間的活性環(huán)(activation loop)，可以作為其他蛋白激酶磷酸化作用的靶位點。小麥是我國主要的的糧食作物，但是低溫、干旱、鹽漬化、高pH值和低鉀等非生物脅迫都嚴重影響了小麥的產量和品質，Ca2+-CBL-CIPK網絡信號通路對逆境脅迫有一定應答作用。小麥中的Ca2+-CBL-CIPK調控網絡研究遠落后于模式植物擬南芥和水稻，為了進一步了解小麥中TaCIPK和TaCBL的分子機制和功能結構，通過同

3、源克隆的方法克隆了TaCIPK和TaCBL家族的部分基因，對其進行生物信息學分析;利用熒光定量PCR(Real-time PCR)的方法分析TaCIPK基因在不同逆境脅迫條件下的組織特異性表達及時空特異性表達;通過酵母雙雜交(Yeast Two-hybrid System)方法驗證了TaCIPKs和TaCBLs之間互作調控網絡。主要研究結果如下:
　　1、利用同源克隆方法，從小麥中克隆了TaCBL3、TaCBL9和TaCIPK3、

4、TaCIPK11。TaCBL3的ORF長度為678bp，編碼225個氨基酸;TaCBL9的ORF長度為891bp，編碼296個氨基酸;TaCIPK3的編碼區(qū)全長1677bp，ORF長度為1348bp，編碼447個氨基酸殘基，相對分子質量為50.5kD，等電點為8.6;TaCIPK11的編碼區(qū)全長為1926bp，ORF長度為1524bp，包含507個氨基酸殘基，相對分子質量為57.5kD，等電點為8.75。
　　2、同源性分析表明小

5、麥TaCBL家族的基因與擬南芥、水稻、二穗短柄草、大麥等家族基因的氨基酸序列同源性都比較高。其中TaCBL9與野大麥HbCBL9、水稻OsCBL9同源性分別達到78％、74％;TaCBL3與大麥HvCBL3、玉米ZmCBL3、水稻OsCBL3的同源性分別到96％、94％、94％。功能結構域分析表明TaCBL3和TaCBL9基因編碼的蛋白均含有3個典型的EF-hand結構。
　　3、TaCIPK3和TaCIPK11與其他植物中CIP

6、K家族氨基酸間的同源性很高，TaCIPK3與山羊草AeCIPK31、烏拉爾圖小麥TuCIPK31、短柄草BdCIPK31的相似性分別高達100％、96％、90％;TaCIPK11與山羊草AeCIPK11、烏拉爾圖小麥TuCIPK11、短柄草BdCIPK11、大麥HvCIPK11的相似性都達到了90％以上。對TaCIPK3和TaCIPK11進行氨基酸序列比對，表明小麥TaCIPK3和TaCIPK11蛋白都含有N端激酶域和C端調節(jié)域，含有蛋

7、白激酶激活環(huán)(Activation loop)和NAF/FISL基序結構用于結合TaCBL，屬于絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶家族。
　　4、在200mM NaCl(高鹽脅迫)、100μM ABA（離子脅迫）、4℃（低溫脅迫）等條件處理下對TaCIPK3和TaCIPK11的表達模式進行了定量分析，結果表明:TaCIPK3在高鹽誘導處理下根中和葉中呈上調表達;在ABA誘導處理下呈下調表達;低溫誘導處理根中的TaCIPK3上調表達，而葉中Ta

8、CIPK3呈下調表達。高鹽誘導葉中TaCIPK11上調表達，根中TaCIPK11下調表達;ABA誘導處理根和葉中TaCIPK11上調表達;低溫誘導處理根中的TaCIPK11和葉中的TaCIPK11上調表達。
　　5、借助酵母雙雜交系統(tǒng)，驗證TaCIPK3以及TaCIPK11與TaCBLs的互作調控網絡，在酵母雙雜交系統(tǒng)中，TaCBL1/2/3/4/6/7/9連入DNA-pGBKT7載體中，構建pGBKT7-TaCBL1/2/3/4

9、/6/7/9融合蛋白;TaCIPK3/11連入pGADT7-T載體中，構建pGADT7-TaCIPK3/1融合蛋白。酵母雙雜交實驗中陽性對照pGBKT7-53×pGADT7-T、融合酵母Y187和Y2HGold(pGBKT7-TaCBL1×pGADT7-TaCIPK3、pGBKT7-TaCBL2×pGADT7-TaCIPK3、pGBKT7-TaCBL3×pGADT7-TaCIPK3、pGBKT7-TaCBL4×pGADT7-TaCIPK

10、3）以及二倍體融合酵母Y187和Y2HGold(pGBKT7-TaCBL2×pGADT7-TaCIPK11、pGBKT7-TaCBL3×pGADT7-TaCIPK11、pGBKT7-TaCBL6×pGADT7-TaCIPK11、pGBKT7-TaCBL9×pGADT7-TaCIPK11)能在選擇性固體培養(yǎng)基SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/X-α-Gal/AbA上生長，并且菌落呈淡藍色，而陰性對照Y187和Y2HGold(p