小麥Ta-SKP2A基因的表達(dá)特性分析及其互作靶蛋白篩選.pdf

1、F-box蛋白作為SCF復(fù)合體中泛素-蛋白連接酶E3的關(guān)鍵組份，在植物生長(zhǎng)發(fā)育、激素信號(hào)傳導(dǎo)、花器官發(fā)育和自交不親和反應(yīng)中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。近年來(lái)，越來(lái)越多的研究表明F-box蛋白介導(dǎo)的泛素降解途徑也應(yīng)對(duì)非生物及生物脅迫的響應(yīng)過(guò)程。本研究通過(guò)對(duì)F-box/LRR類(lèi)基因進(jìn)行克隆、基因誘導(dǎo)表達(dá)分析、誘餌載體構(gòu)建以及酵母雙雜交文庫(kù)篩選等方法，對(duì)Ta-SKP2A基因進(jìn)行了系統(tǒng)研究。主要研究結(jié)果如下:
　　1、利用生物信息學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)庫(kù)中

2、小麥F-box基因進(jìn)行了分析、整理、歸類(lèi)。DFCI和NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中共檢索到符合條件的F-box基因38條，根據(jù)F-box蛋白C端結(jié)構(gòu)域的不同，將其劃分為三類(lèi):F-box/LRR（17條，占總數(shù)的45％）、F-box/Kelch（6條，占總數(shù)的16％）和C端無(wú)明顯結(jié)構(gòu)域（15條，占總數(shù)的39％）。
　　2、克隆了兩條小麥F-box基因Ta-SKP2A和Ta-FB。Ta-SKP2A基因包含完整的ORF區(qū)，編碼382個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)的多

3、肽分子量為40.87kDa，屬于F-box/LRR類(lèi)型;Ta-FB序列較短，未包含完整的ORF區(qū)，為C末端無(wú)明顯結(jié)構(gòu)域的F-box蛋白。
　　3、組織表達(dá)模式結(jié)果表明:Ta-SKP2A在中國(guó)春小麥雌蕊中高表達(dá)，為幼葉表達(dá)量的7.5倍;在TcLr15小麥旗葉中的表達(dá)量高，為幼葉中表達(dá)量的6.5倍;在TcLr38的各個(gè)組織中的表達(dá)量均較低。在受葉銹菌侵染后，不同抗/感組合中Ta-SKP2A基因呈現(xiàn)不同的表達(dá)模式，TcLr15與葉銹菌株

4、05-5-137③形成的感病組合中，Ta-SKP2A的相對(duì)表達(dá)量最高，CS與05-5-137③形成的感病組合中總體表達(dá)量最低。黑暗保濕對(duì)該基因的表達(dá)影響不大。TcLr15中Ta-SKP2A基因主要受ABA的誘導(dǎo)，反應(yīng)較遲(12h)，總體上受IAA、ABA、MeJA三種激素的影響較小。CS中Ta-SKP2A基因受這三種激素的影響較大，尤其是ABA和MeJA，且反應(yīng)出現(xiàn)較早。
　　4、成功構(gòu)建了中國(guó)春小麥的酵母雙雜交文庫(kù)和包含Ta-S

5、KP2A基因的誘餌載體pGBKT7-Ta-SKP2A。文庫(kù)的滴度為9.9×108cfu/mL。文庫(kù)插入片段大小為250bp～2500bp。誘餌質(zhì)粒對(duì)酵母菌生長(zhǎng)無(wú)毒害作用和自激活活性。
　　5、篩選出與Ta-SKP2A有相互作用的候選蛋白8個(gè)，分別為小麥蛋白激酶、信號(hào)錨、鐵蛋白、AZM、SKP1/ASK1、核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶/加氧酶、Kunitz-type蛋白酶抑制劑、磷酸核酮糖激酶PRK。經(jīng)X-α-Gal染色驗(yàn)證，表明R