小麥WOX基因的克隆與表達(dá)分析.pdf

1、本研究以小麥及其近緣屬作為研究材料，通過(guò)同源克隆，熱不對(duì)稱(chēng)交錯(cuò)PCR及RT-PCR等方法，成功分離得到WOX2和WOX5s基因序列，并對(duì)TaWOX2和TaWOX5s基因的表達(dá)及功能進(jìn)行了研究，了解它們?cè)谛←溑咛グl(fā)生過(guò)程中的作用。本研究主要結(jié)果如下:
　　1.克隆得到了小麥WOX2基因序列，全長(zhǎng)為2045bp，編碼區(qū)長(zhǎng)度為969bp，編碼322個(gè)氨基酸殘基。在氨基酸水平上進(jìn)行序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，小麥WOX2與OsWOX2和ZmWOX2A的

2、homeodomain區(qū)域相似性達(dá)89.6％和85.1％，并且該基因序列具有WOX家族現(xiàn)代進(jìn)化支的2個(gè)保守結(jié)構(gòu)域，homeodomain和WUS-box。據(jù)此認(rèn)為，克隆到的序列編碼小麥WOX2蛋白，命名為T(mén)aWOX2。
　　2.克隆得到了小麥WOX5基因序列，序列分析的結(jié)果表明WOX5基因分為三種等位變異類(lèi)型，全長(zhǎng)分別為1038bp、1029bp和1032bp，編碼區(qū)長(zhǎng)度分別為639bp、630bp和633bp，編碼209-212

3、個(gè)氨基酸殘基。將克隆得到的序列與水稻和玉米WOX5蛋白序列進(jìn)行比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)TaWOX5a與OsWOX5和ZmWOX5B的相似性分別是78.8％和65.5％，并且TaWOX5s的homeodomain區(qū)域氨基酸序列與水稻玉米的該區(qū)域完全一致。TaWOX5s具有WOX家族現(xiàn)代進(jìn)化支的3個(gè)保守結(jié)構(gòu)域，分別是homeodomain、WUS-box和EAR-like。據(jù)此認(rèn)為，克隆到的序列編碼小麥WOX5蛋白，分別命名為T(mén)aWOX5a，TaWO

4、X5b和TaWOX5c。在小麥近緣屬材料中克隆到的WOX5基因高度同源，只存在兩個(gè)位點(diǎn)的插入缺失變異。
　　3.分別將TaWOX2和TaWOX5c分別連入原核表達(dá)載體pET-30a，轉(zhuǎn)入大腸桿菌 BL21(DE3)中，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)基因成功表達(dá)，得到約34kDa和26kDa的重組蛋白。重組蛋白的分子量大小與核酸序列預(yù)測(cè)結(jié)果一致，表明克隆到的序列準(zhǔn)確代表了該基因的開(kāi)放閱讀框。
　　4.通過(guò)熒光定量PCR分析了這兩個(gè)基因在普通小

5、麥中的表達(dá)模式，TaWOX2主要在種子發(fā)育過(guò)程中表達(dá)，TaWOX2在種子發(fā)育過(guò)程中的表達(dá)水平很有可能反映了其在胚發(fā)育過(guò)程中的表達(dá)水平，因此，推測(cè)TaWOX2基因和小麥的胚發(fā)育相關(guān)。Ta WOX5主要在根和愈傷組織中表達(dá)，在愈傷組織中，TaWOX5s在2，4-D的誘導(dǎo)下表達(dá)量逐漸升高，而在NAA，6-BA，玉米素和激動(dòng)素的誘導(dǎo)下表達(dá)量降低。因此，推測(cè)TaWOX5s可能與小麥根的形成和發(fā)育有關(guān)，并且TaWOX5的表達(dá)受生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素的調(diào)