小麥與葉銹菌互作體系中TaHIR2基因克隆及其特性分析.pdf

1、過敏性反應(yīng)(Hypersensitive Response,HR)是植物抗病機制中最常見的一種抗病表現(xiàn)形式。過敏性誘導(dǎo)反應(yīng)蛋白是參與植物HR過程的一類蛋白。目前在小麥上尚未見TaHIR2的報道。為明確TaHIR2及其所編碼蛋白在小麥中的存在狀況及其與小麥抗葉銹病性的關(guān)系,本研究以受葉銹菌侵染的小麥抗葉銹病近等基因系TcLr15為材料,利用PCR技術(shù)克隆獲得小麥過敏性誘導(dǎo)反應(yīng)蛋白2(TaHIR2)的cDNA及基因組DNA序列；利用實時定量

2、PCR(qRT-PCR)技術(shù)對小麥與葉銹菌親和及非親和互作過程中TaHIR2的表達模式進行了分析；通過構(gòu)建原核表達載體對該基因進行原核表達,產(chǎn)生的蛋白用于制備抗體,利用Western雜交技術(shù)對小麥中該基因所編碼蛋白的表達情況進行檢測；構(gòu)建了含有TaHIR2基因的重組質(zhì)粒,通過基因槍介導(dǎo)法分別對小麥品種TcLr15和Thatcher的成熟胚性愈傷組織進行了轉(zhuǎn)化。主要內(nèi)容包括以下幾個方面:
　　 1.小麥TaHIR2基因克隆及序列分

3、析。以小麥抗葉銹病近等基因系TcLr15和非親和葉銹菌株05-19-43②為材料,以接菌24 h、48 h和72 h小麥葉片總RNA的等量混合物為模板,通過RT-PCR技術(shù)獲得小麥TaHIR2的cDNA序列。同時以TcLr15的基因組DNA為模板,通過PCR技術(shù)獲得TaHIR2的DNA序列。
　　 2.小麥TaHIR2B寸空表達模式分析。以接種非親和葉銹菌05-19-43②和親和葉銹菌05-5-137③的小麥TcLr15葉片為材

4、料,應(yīng)用qRT-PCR技術(shù)檢測接種不同毒力葉銹菌后小麥葉片中TaHIR2的時間表達模式。結(jié)果表明TaHIR2受葉銹菌誘導(dǎo)18 h時表達量均上升,在接種36 h時達到最大,然后下降。但在非親和組合中,24 h和36 h的表達量要明顯高于親和組合。以小麥TcLr15的幼根、幼莖、幼葉和種子為材料,應(yīng)用qRT-PCR技術(shù)檢測TaHIR2在這幾種組織中的表達量差異。結(jié)果表明TaHIR2在小麥幼葉中的表達量最大。
　　 3.TaHIR2蛋

5、白在葉銹菌侵染不同時間點的小麥葉片中表達模式分析。將TaHIR2基因的編碼區(qū)插入到表達載體pET-30(+)中,獲得原核表達載體TaHIR2-pET-30a,重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌表達菌株BL21(DE3)。對陽性菌株的蛋白表達條件進行優(yōu)化,確定IPTG的最佳誘導(dǎo)濃度為0.3 mM,最佳誘導(dǎo)時間為7 h。表達的融合蛋白分子量為37 kDa左右,該蛋白存在于包涵體中。用Ni2+-His親和層析柱對蛋白進行純化后,經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測呈

6、現(xiàn)單一條帶。純化的蛋白用于免疫兔子,制備抗體,當(dāng)效價達到1:76800時,利用Western雜交檢測抗體質(zhì)量,并對小麥中TaHIR2蛋白的表達情況進行檢測。雜交結(jié)果表明,在小麥中確實存在TaHIR2蛋白。對葉銹菌侵染不同時間點的小麥葉片中TaHIR2蛋白的表達模式進行分析。結(jié)果表明在非親和組合中,TaHIR2蛋白的表達量在檢測的時間進程中平穩(wěn)增長,60 h時達到最大,而在親和組合中,蛋白的表達量在96 h時達到最大。
　　 4.

7、TaHIR2基因植物高效表達載體構(gòu)建及再生小麥幼苗獲得。將TaHIR2基因的編碼區(qū)定向插入到載體pAHC-25中,獲得重組質(zhì)粒TaHIR2-pAHC-25,利用基因槍介導(dǎo)法將該重組載體轉(zhuǎn)化小麥品種TcLr15和Thatcher的成熟胚性愈傷組織,經(jīng)分化篩選后獲得再生的小麥幼苗。
　　 本研究在克隆獲得小麥TaHIR2 cDNA及基因組DNA序列基礎(chǔ)上,利用實時定量、Western雜交及轉(zhuǎn)基因等技術(shù)對TaHIR2基因進行系統(tǒng)研究,