殼聚糖纖維及明膠增強(qiáng)的磷酸鈣骨水泥治療骨缺損的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的:磷酸鈣骨水泥是上世紀(jì)八十年代出現(xiàn)的一種新型可吸收的骨替代材料，但是強(qiáng)度低、降解慢、缺乏韌性及約束力等不足使其臨床應(yīng)用范圍受到限制。本研究將殼聚糖纖維、明膠與磷酸鈣骨水泥按適當(dāng)比例制成混合物，測定其理化及生物學(xué)特性，探索其在矯形外科的臨床應(yīng)用可能。 方法:(1)通過掃描電鏡觀察、密度、膨脹率、抗張強(qiáng)度測定分析殼聚糖纖維的特征。粘度分析法測量雞卵清溶菌酶體外降解纖維作用，大鼠肌肉植入試驗(yàn)了解纖維體內(nèi)吸收，大鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)

2、了解纖維細(xì)胞毒性。(2)分別以5wt％明膠和蒸餾水為液相制備磷酸鈣骨水泥固化體，測定水泥初步凝結(jié)時(shí)間、抗彎強(qiáng)度。掃描電鏡觀察其表面形態(tài)，大鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞種植試驗(yàn)了解添加明膠對水泥細(xì)胞相容性的影響。(3)培養(yǎng)3周及3月齡SD大鼠股骨骨髓基質(zhì)細(xì)胞，成骨性培養(yǎng)液誘導(dǎo)分化，通過相差顯微鏡觀察，MTT法檢測細(xì)胞增殖，鈣鈷法、茜素紅染色了解體外礦化，測定細(xì)胞總蛋白含量，RT-PCR測Ⅰ型膠原mRNA表達(dá)，透射電鏡觀察等方法比較兩種細(xì)胞的差異。(4)

3、通過測定抗彎曲強(qiáng)度，分析固化體相組成、觀察超微結(jié)構(gòu)及體外細(xì)胞反應(yīng)，了解殼聚糖纖維-明膠-磷酸鈣骨水泥復(fù)合材料的理化性能及細(xì)胞毒性。(5)通過測定抗張強(qiáng)度、抗彎曲強(qiáng)度，觀察微結(jié)構(gòu)、分析紅外光譜、電子能譜等手段探討殼聚糖纖維、明膠聯(lián)合增強(qiáng)磷酸鈣骨水泥可能的機(jī)理。(6)制備兔股骨髁上腔性骨缺損模型，分別植入預(yù)固化磷酸鈣水泥和殼聚糖纖維-明膠-磷酸鈣復(fù)合物，術(shù)后1月、3月、6月和12月取材，通過X線、大體觀察、硬組織切片組織學(xué)分析等方法評估兩種

4、材料體內(nèi)吸收及成骨情況。(7)高溫煅燒焦磷酸鈣與碳酸鈣混合物，通過X線衍射分析和掃描電鏡觀察，了解不同溫度和保溫時(shí)間下所得磷酸四鈣純度及表面形態(tài)。 結(jié)果:(1)殼聚糖纖維光滑，密度1.093±0.270g/cm3，膨脹率2.30±0.21，抗張強(qiáng)度80.18±1.56MPa。加入溶菌酶2小時(shí)特性粘度下降約1/2，以后漸趨穩(wěn)定。植入肌肉1周炎癥反應(yīng)明顯。4周時(shí)吸收不明顯，12周大部分吸收。共培養(yǎng)細(xì)胞可粘附纖維生長。(2)添加明膠后

5、磷酸鈣骨水泥的初步凝結(jié)時(shí)間縮短為5.31±1.18分，對照組為20.72±4.13分；抗彎強(qiáng)度提高到6.14±0.97MPa；對照組為2.48±0.62MPa。固化體表面晶體為顆粒狀，大小約10μm，添加明膠后顆粒狀晶體互相連接，孔隙減少。細(xì)胞可在水泥表面貼附、生長。(3)幼鼠細(xì)胞增殖快，倍增時(shí)間4.8天；培養(yǎng)第7天出現(xiàn)較多集落；鈣鈷法、茜素紅染色深染細(xì)胞數(shù)多，結(jié)節(jié)典型；總蛋白含量高。成齡鼠細(xì)胞增殖相對慢，倍增時(shí)間5.4天；未見細(xì)胞集落

6、；總蛋白含量低。兩種細(xì)胞瓊脂糖電泳均可顯示Ⅰ型膠原mRNA條帶；幼鼠細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)豐富，胞外基質(zhì)中前膠原樣結(jié)構(gòu)相對豐富。(4)殼聚糖纖維體積比對抗彎強(qiáng)度影響顯著，體積比增加到30％，強(qiáng)度最大為12.31Mpa。纖維及明膠促進(jìn)水泥向羥基磷灰石轉(zhuǎn)化，各復(fù)合物在31°和35°之間均可見與標(biāo)準(zhǔn)羥基磷灰石一致的衍射峰。掃描電鏡顯示纖維分散較好，并被水泥濕化。大鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞可在復(fù)合物表面生長。短期抽提實(shí)驗(yàn)證實(shí)細(xì)胞生長無抑制。(5)5wt％和10wt％

7、明膠浸制后的殼聚糖纖維張力強(qiáng)度分別為85.43和91.67MPa，分別比純纖維(80.5MPa)提高1.06及1.14倍。紅外光譜分析提示纖維和明膠間發(fā)生相互作用。力學(xué)試驗(yàn)顯示5wt％明膠和體積比為30％殼聚糖纖維構(gòu)成的復(fù)合物抗彎曲強(qiáng)度最大，當(dāng)纖維體積比增加到50％時(shí)，強(qiáng)度降低。5wt％明膠和體積比30％殼聚糖纖維構(gòu)成的磷酸鈣骨水泥復(fù)合物之?dāng)嗫诜治鲆姲纬隼w維表面粘附有大量的水泥顆粒。(6)兩種材料在任意時(shí)間點(diǎn)未見不良反應(yīng)，1m后復(fù)合材料

8、的降解及成骨均優(yōu)于單純水泥組，在觀察時(shí)間段(12m)內(nèi)，純水泥組僅表面發(fā)生降解，降解率不足20％，復(fù)合材料組呈多方位降解，降解率達(dá)67％。(7)燒結(jié)磷酸四鈣所需的最低溫度為1350℃，保溫3小時(shí)和6個(gè)小時(shí)制備的磷酸四鈣純度均可達(dá)到90％以上，而且兩種條件得到磷酸四鈣的超微形態(tài)類似。 結(jié)論:(1)殼聚糖編織纖維具有一定強(qiáng)度、良好的生物可降解性及生物相容性，適合構(gòu)建骨或者軟骨組織工程支架。(2)添加明膠可縮短磷酸鈣骨水泥的固化時(shí)間，

9、提高抗彎強(qiáng)度及生物相容性。(3)不同鼠齡的骨髓基質(zhì)細(xì)胞經(jīng)體外誘導(dǎo)均可分化為成骨細(xì)胞，考慮到細(xì)胞增殖及成骨潛能，幼鼠基質(zhì)細(xì)胞是研究細(xì)胞/生物材料相互作用更理想的工具。(4)添加殼聚糖纖維和明膠在一定程度上提高了骨水泥強(qiáng)度，加速骨水泥向羥基磷灰石轉(zhuǎn)化，新型復(fù)合材料無細(xì)胞毒性。(5)殼聚糖纖維和明膠作為增強(qiáng)劑可以顯著改善水泥的抗彎曲強(qiáng)度，5wt％的明膠和體積比30％的殼聚糖纖維為這種增強(qiáng)模式較為合適的比例。其機(jī)理可能與材料之間發(fā)生的化學(xué)結(jié)合、