靶向CXCL10-CXCR3的放射性核素示記分子實時監(jiān)測同種移植排斥的研究.pdf

1、目的：器官移植是治療多種終末期疾病的唯一有效手段，但急性移植排斥反應(yīng)(acute rejection，AR)依然多發(fā)。AR是導(dǎo)致移植器官損害以致失活的重要原因，嚴(yán)重影響患者預(yù)后。急性移植排斥反應(yīng)的早期特異性無創(chuàng)性診斷技術(shù)對保護移植器官，延長移植器官存活期有重要意義。大量研究表明，外周血及尿中趨化因子配體10(CXCL10，C-X-C motif chemokine10)在器官移植前及器官移植后的變化對移植器官預(yù)后有一定預(yù)測意義。CXCL

2、10與其受體趨化因子受體3(CXCR3，C-X-C motif receptor3)共同介導(dǎo)包括Th1細胞在內(nèi)的多種CXCR3陽性免疫細胞到急性排斥部位的募集，并且在AR發(fā)生免疫細胞募集的早期階段即開始發(fā)揮重要作用，其在移植器官局部的表達量與AR發(fā)生密切相關(guān)。在促炎微環(huán)境下CXCL10能夠被中性粒細胞，嗜酸性粒細胞，單核細胞，內(nèi)皮細胞，上皮細胞，基質(zhì)絀胞和角質(zhì)細胞等多種絀胞分泌，并且表達上調(diào)早于CXCR3的另一配體CXCL9，因此檢測局

3、部CXCL10的表達量能夠比檢測CXCL9更早地診斷CXCR3陽性免疫絀胞的浸潤。
　　分子影像學(xué)技術(shù)快速發(fā)展使在活體狀態(tài)下無創(chuàng)性實時監(jiān)測某一靶分子的分布及相對量成為可能。本論文在確定CXCL10是一與AR起始密切相關(guān)的靶點的基礎(chǔ)上，成功制備了CXCL10靶向特異的131I-anti-CXCL10mAb分子探針，并對CXCL10的分布進行放射性顯像，探討其在AR早期診斷中的應(yīng)用價值。由于131I-anti-CXCL10 mAb分子

4、量大，其體內(nèi)分布及排除較緩慢，藥物代謝動力學(xué)不夠理想，因此本課題第二部分探討了以小分子125I-CXCL10(8.5Kd)為探針，以其受體CXCR3為靶點，實時監(jiān)測AR的可行性。
　　第一部分:以CXCL10為靶點的早期急性移植排斥顯像研究
　　研究方法：
　　1.建立同種皮膚移植小鼠模型:以C57BL/6小鼠為供體，BALB/c小鼠為受體建立同種皮膚移植模型，同時以BALB/c小鼠為供體，BALB/c小鼠為受體建立同

5、系皮膚移植模型。逐日觀察移植物生存狀況。1mg/kg.d他克莫司腹腔給藥的藥物處理同種移植模型建立同種移植免疫抑制模型。移植后第10天用HE染色驗證各組皮片處排斥狀況。
　　2.CXCL10 mRNA及蛋白的檢測:于移植后第10天分別取移植部位皮片及對側(cè)正常皮片進行RT-PCR檢測CXCL10 mRNA的相對表達。同時利用免疫組織化學(xué)分析法及ELISA法測定移植后第10天移植皮片、血液和脾中CXCL10蛋白表達狀況。
　　3

6、.放射性碘化標(biāo)記: Iodogen法131I標(biāo)記anti-CXCL10 mAb，紙層析法檢測放射性化學(xué)純度及穩(wěn)定性。
　　4.體內(nèi)生物學(xué)分布研究:小鼠皮膚移植后第8天尾靜脈注射131I-anti-CXCL10 mAb后不同時間處死小鼠，取移植皮片及主要器官，稱重，測量放射性，研究觀察131I-anti-CXCL10的體內(nèi)生物分布狀況及靶向性。
　　5.放射性磷屏顯像研究:小鼠皮膚移植后第8天尾靜脈注射131I-anti-CX

7、CL10 mAb后不同時間麻醉小鼠后，進行放射性磷屏131 I-anti-CXCL10的體內(nèi)生物分布顯像。大劑量未標(biāo)記的anti-CXCL10 mAb尾靜脈預(yù)先注射進行阻斷實驗，驗證131I-anti-CXCL10靶向特異性。
　　研究結(jié)果：
　　1.成功制備同種及同系移植模型;移植后第10天時同種移植組皮片處可見大量淋巴細胞浸潤，排斥反應(yīng)明顯;他克莫司藥物處理組淋巴細胞浸潤較未用藥組顯著減少，排斥反應(yīng)較輕;同系移植組未見明

8、顯淋巴絀胞浸潤，無明顯排斥反應(yīng)。
　　2.RT-PCR，ELISA以及免疫組化結(jié)果均顯示:與同系對照組及他克莫司處理的同種移植組相比，未處理同種移植組移植皮片CXCL10表達最高，他克莫司處理能顯著抑制同種移植皮片及脾的CXCL10表達，降低血中CXCL10水平。
　　3.成功制備了131I-anti-CXCL10 mAb，其放射化學(xué)純度較高(98％)，穩(wěn)定性較好，制備后72 h放射化學(xué)純度仍高于95％。
　　4.體內(nèi)

9、生物分布數(shù)據(jù)同時顯示藥物經(jīng)肝臟代謝、腎臟排泄。同種移植皮片處放射性濃聚最高，與顯像結(jié)果相一致。同種移植組在給藥后72 h時的靶/非靶比值為4.15±0.25，明顯較他克莫司處理組靶/非靶比值(2.29±0.10)高。
　　5.磷屏放射自顯影顯示，同種移植皮片在注射顯像劑后的6h至72 h的各檢測時間點均清晰顯像，而他克莫司處理組放射性濃聚不明顯，同系對照組未發(fā)現(xiàn)放射性濃聚。尾靜脈預(yù)先注射大劑量未標(biāo)記CXCL10 mAb可顯著減低同

10、種移植皮片對131I-anti-CXCL10 mAb的攝取。
　　研究結(jié)論:
　　1.CXCL10可以作為早期急性移植排斥的分子顯像診斷靶點，需進一步研究。
　　2.131I-anti-CXCL10 mAb能夠成功地進行以CXCL10為靶點的急性排斥反應(yīng)顯像，并且能夠檢測免疫抑制藥物的作用。
　　第二部分:小分子顯像劑125 I-CXCL10監(jiān)測早期急性移植排斥的研究
　　研究方法：
　　1.建立皮膚

11、移植小鼠模型并檢測CXCR3表達:制備以BALB/c小鼠為供體，BALB/c小鼠為受體的同系皮膚移植模型，以C57BL/6小鼠為供體，BALB/c小鼠為受體的同種皮膚移植模型。取移植后第9天小鼠進行RT-PCR及免疫組化法驗證移植皮片處CXCR3表達。
　　2.放射性碘化標(biāo)記:四氯二苯基苷脲(Iodogen)法125I標(biāo)記CXCL10，紙層析法檢測放射性化學(xué)純度及穩(wěn)定性。
　　3.結(jié)合特異性驗證:取同種移植第8天的小鼠脾細胞

12、進行125I-CXCL10與CXCR3陽性脾細胞的受體放射性配基結(jié)合實驗。
　　4.藥物代謝動力學(xué)實驗:取同種移植第8天小鼠尾靜脈注射125I-CXCL10后進行藥物代謝動力學(xué)實驗。
　　5.體內(nèi)生物分布:小鼠皮膚移植后第8天尾靜脈注射125I-CXCL10后觀察CXCR3陽性細胞的體內(nèi)生物分布。
　　6.皮膚移植小鼠磷屏自顯影顯像。
　　研究結(jié)果：
　　1.CXCR3表達狀況:RT-PCR及免疫組化染色結(jié)

13、果均顯示:與同系對照組相比，同種移植組移植皮片CXCR3表達量明顯較高;同系組CXCR3表達量與對側(cè)正常皮片處無顯著差異。
　　2.成功制備了125I-CXCL10，放化純?yōu)?8％，穩(wěn)定性好，72 h時仍高于95％。
　　3.受體放射性配基結(jié)合實驗結(jié)果表明125I-CXCL10可與細胞特異性結(jié)合，平衡解離常數(shù)KD值為3.48±0.31nM，其免疫活性約為90％。
　　4.藥物代謝動力學(xué)分析表明，125I-CXCL10具

14、有較好的藥物代謝動力學(xué)特性，符合二室分布模型，其分布相半衰期為0.34 h，消除相半衰期為9.83h。
　　5.24h時的體內(nèi)生物分布研究結(jié)果顯示實驗組同種移植皮片放射性濃集明顯，靶/非靶比值為3.01±0.25;同系對照組移植皮片無明顯放射性濃集，靶/非靶比值為1.14±0.10，與正常對側(cè)皮膚無顯著差異。
　　6.全身磷屏顯像結(jié)果顯示，注射125I-CXCL10顯像劑3h時，同種移植皮片即可清晰顯像，隨顯像劑的排出本底降