補(bǔ)體抗動(dòng)脈粥樣硬化和調(diào)節(jié)Toll樣受體致炎作用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的： 1.通過(guò)分別把CD55-/-和CD59-/-小鼠與ApoE-/-小鼠雜交，獲得易形成AS斑塊的雙基因敲除小鼠； 2.通過(guò)對(duì)雙敲小鼠的病變范圍、斑塊大小和病灶內(nèi)容物進(jìn)行分析，研究補(bǔ)體膜調(diào)節(jié)蛋白-CD55和CD59在AS發(fā)生發(fā)展中的作用； 3.通過(guò)對(duì)血脂、血尿、補(bǔ)體激活和T細(xì)胞免疫的分析，探討CD55和CD59抗AS的機(jī)制。 方法： 1.獲取雙基因敲除小鼠及高脂喂養(yǎng) 把CD55-/-小

2、鼠與ApoE-/-小鼠雜交，獲得CD55+/-ApoE--雜合子，以雜合子小鼠交配繁殖獲得CD55-/-ApoE-/-小鼠和同齡野生型對(duì)照-CD55+/+ApoE-/-小鼠。 2.血液及尿液分析 應(yīng)用酶法測(cè)定血清總膽固醇水平。應(yīng)用代謝籠連續(xù)24小時(shí)收集小鼠的尿液，并應(yīng)用HPLC/MS/MS法分析尿液中脂質(zhì)代謝產(chǎn)物8，12-iso-iPF2α-V和肌酐的水平。 3.斑塊大小分析 將主動(dòng)脈縱剖后釘于蠟版，并進(jìn)

3、行蘇丹Ⅳ染色分析。病變范圍表示為AS斑塊占主動(dòng)脈表面積的百分比。將小鼠心臟進(jìn)行6μm連續(xù)冰凍切片，收集自出現(xiàn)三個(gè)主動(dòng)脈瓣葉起至瓣尖的切片。對(duì)冰凍切片進(jìn)行油紅O染色，照相并應(yīng)用軟件分析。斑塊大小表示為斑塊占主動(dòng)脈根面積的百分比。 4.病理學(xué)檢測(cè) 對(duì)主動(dòng)脈竇部冰凍切片行免疫組化染色和天狼星紅染色，測(cè)量斑塊內(nèi)平滑肌細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、C3、C9和膠原的陽(yáng)性染色面積，其含量表示為陽(yáng)性染色面積占斑塊總面積的百分比。對(duì)切片行CD4和CD

4、8免疫組化染色，計(jì)數(shù)單位面積內(nèi)的陽(yáng)性細(xì)胞個(gè)數(shù)。 5.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 定量數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，應(yīng)用Graphpad公司的Prism3.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。在做分析之前，對(duì)所有的數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)分布檢驗(yàn)。對(duì)于正態(tài)分布的數(shù)據(jù)應(yīng)用雙側(cè)t檢驗(yàn)，對(duì)非正態(tài)分布的數(shù)據(jù)應(yīng)用Mann-Whiteney分析。設(shè)P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)果： 1.CD59的抗AS作用 短期雌性組內(nèi)，雖然主動(dòng)脈表面病灶范圍并無(wú)組間差異，但

5、是CD59-/-ApoE-/-小鼠主動(dòng)脈竇部的斑塊明顯大于CD59+/+ApoE-/-對(duì)照。然而，短期雄性組內(nèi)，雄性CD59-/-ApoE-/-小鼠與CD59+/+ApoE-/-對(duì)照間未發(fā)現(xiàn)顯著差異。長(zhǎng)期雌性組內(nèi)，CD59基因缺陷明顯地增加了雌性小鼠的病變覆蓋范圍，但是卻未對(duì)主動(dòng)脈竇部的斑塊大小產(chǎn)生明顯的影響。與短期雄性組的結(jié)果相似，在長(zhǎng)期雄性組內(nèi)未發(fā)現(xiàn)顯著差異。CD59基因缺陷導(dǎo)致了病變覆蓋范圍的擴(kuò)大或局部斑塊的增大，提示CD59具有

6、明顯的抗AS作用。然而，無(wú)論是在短期還是長(zhǎng)期雄性組內(nèi)，均未發(fā)現(xiàn)顯著的差異，提示CD59的抗AS作用存在明顯的性別差異。 2.CD55缺陷與AS 與CD59基因缺陷的結(jié)果不同，無(wú)論在雄性還是雌性組，CD55基因敲除均未引起明顯的病變范圍或斑塊大小的改變。在短期雌性組，雌性CD55-/-ApoE-/-和CD55+/+ApoE-/-小鼠的病變范圍和斑塊大小無(wú)顯著差異；同樣的結(jié)果也見(jiàn)于短期雄性組。在長(zhǎng)期雌性組，CD55-/-Ap

7、oE-/-與CD55+/+ApoE-/-小鼠的病變范圍和斑塊大小無(wú)顯著差異；長(zhǎng)期雄性組內(nèi)，也未發(fā)現(xiàn)明顯的差異。 3.CD59缺陷對(duì)斑塊構(gòu)成的影響 通過(guò)對(duì)短期雌性組的病理學(xué)分析，我們研究了CD59基因缺陷對(duì)斑塊內(nèi)各種成份的影響。 4.CD59抗AS作用的機(jī)制 血清學(xué)分析顯示，短期雌性組內(nèi)，CD59--ApoE--小鼠的血清總膽固醇顯著高于CD59+/+ApoE-/-小鼠，提示CD59可能通過(guò)降低血清總膽固醇

8、發(fā)揮抗AS作用。 結(jié)論： 1.CD59可能通過(guò)降低血清總膽固醇和減少補(bǔ)體效應(yīng)產(chǎn)物-膜攻擊復(fù)合體的生成而發(fā)揮抗AS的作用。該作用與氧化應(yīng)激和GPI介導(dǎo)的T細(xì)胞激活無(wú)明顯的相關(guān)性。CD59的抗AS作用僅見(jiàn)于雌性，具有明顯的性別差異。 2.CD59并沒(méi)有參與斑塊內(nèi)巨噬細(xì)胞的粘附、遷移和增殖過(guò)程，該因子缺陷時(shí)通過(guò)影響其他方面導(dǎo)致了等幅度的巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)；CD59通過(guò)抑制膜攻擊復(fù)合體的形成保護(hù)血管壁平滑肌細(xì)胞免受補(bǔ)體系統(tǒng)的攻

9、擊。 3.CD55基因缺陷并沒(méi)有引起明顯的斑塊大小改變，提示在動(dòng)脈壁保護(hù)的過(guò)程中，其他的C3轉(zhuǎn)化酶抑制劑如Factor H和Crry可能發(fā)揮著更重要的作用。在CD55基因缺陷的情況下，C3轉(zhuǎn)化酶的功能仍然得到了有效的抑制，補(bǔ)體系統(tǒng)并未被有效地激活。 4.主動(dòng)脈表面的病變范圍和竇部的斑塊大小存在失偶聯(lián)的現(xiàn)象，很可能是由于根部的空間有限，在ApoE缺陷較強(qiáng)的致AS背景下，其他基因很難引起明顯的斑塊大小改變。主動(dòng)脈表面具有廣闊

10、的空間，可以作為更恒定的評(píng)價(jià)指標(biāo)。 補(bǔ)體過(guò)敏毒素調(diào)節(jié)Toll樣受體致炎作用的體外研究 背景： 天然免疫系統(tǒng)是機(jī)體抵御病原微生物感染的第一道防線。Toll樣受體和補(bǔ)體是天然免疫系統(tǒng)的兩個(gè)重要組成部分，通過(guò)迅速誘發(fā)炎癥反應(yīng)和激活繼發(fā)的獲得性免疫而在應(yīng)對(duì)致病原的過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用。 目的： 研究?jī)?nèi)皮細(xì)胞是否介導(dǎo)了補(bǔ)體C3a和C5a對(duì)TLRs致炎作用的調(diào)控，并探討其具體的作用機(jī)制。 方法：

11、 1、細(xì)胞及其培養(yǎng) 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞，培養(yǎng)于含10％胎牛血清、0.05 mg/ml內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子、2mML-谷氨酰胺、0.1mg/ml肝素和100 U混合抗生素的以M199為主體的培養(yǎng)基中。H5V為來(lái)源于小鼠心臟的內(nèi)皮細(xì)胞系，培養(yǎng)于含10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基內(nèi)。內(nèi)皮細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)于以0.1％明膠預(yù)先包被的培養(yǎng)皿中，37℃、5％CO2的條件下，2-3天傳代一次。其中第5-7代的HUVEC用于實(shí)驗(yàn)。 2、細(xì)胞毒性實(shí)

12、驗(yàn) 以單劑細(xì)胞增殖分析法研究C3a，、C5a、Pam3CKS4、Poly I：C、LPS和CPG對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的毒性作用，以選出可用的濃度范圍。 3、內(nèi)皮細(xì)胞C5a受體的測(cè)定 以流式細(xì)胞儀分析HUVEC和H5V表面的C5a受體的表達(dá)情況，以確認(rèn)內(nèi)皮細(xì)胞可表達(dá)C5aR。 4、干預(yù)實(shí)驗(yàn) 以1×105個(gè)/孔的濃度將細(xì)胞接種于24孔板，培養(yǎng)24小時(shí)后細(xì)胞大約融合至80％。在分析濃度-效應(yīng)時(shí)，將各TLRs激活劑

13、以培養(yǎng)基梯度稀釋成5個(gè)濃度，刺激24小時(shí)；在分析時(shí)間-效應(yīng)時(shí)，以選定的濃度稀釋TLRs激活劑，分別刺激內(nèi)皮細(xì)胞3、6、9、12、15和24個(gè)小時(shí)。刺激實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，收集培養(yǎng)液用于IL-6或IL-8的ELISA分析，以選出合適的作用濃度和時(shí)間。過(guò)敏毒素和TLRs激活劑聯(lián)合作用時(shí)，用不同濃度的C3a和C5a合并選定濃度的TLRs激活劑刺激80％融合的單層內(nèi)皮細(xì)胞24小時(shí)。 5、酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn) 按照生產(chǎn)廠家提供的實(shí)驗(yàn)步驟，對(duì)稀

14、釋過(guò)的培養(yǎng)液進(jìn)行IL-6、IL-8或chemokine KC的ELISA分析。 結(jié)果： 1、細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn) 應(yīng)用單劑細(xì)胞增殖分析試劑盒，檢測(cè)了補(bǔ)體過(guò)敏毒素和TLRs對(duì)H5V的細(xì)胞毒性作用。結(jié)果顯示，C3a在0-100nM，C5a在0-200nM，Pam3CKS4在0-10000 ng/ml，PolyI：C在0-50μg/ml，LPS在0-1000 ng/ml，CPG在0-160ng/ml為安全的濃度區(qū)域，并未引起明

15、顯的細(xì)胞壞死。 2、C5a受體表達(dá) 應(yīng)用流式分析，發(fā)現(xiàn)在HUVEC和H5V表面有相當(dāng)數(shù)量的C5aR表達(dá)，而同時(shí)染色的陰性對(duì)照-HEK細(xì)胞上幾乎沒(méi)有熒光信號(hào)。 3、C5a和C3a對(duì)TLR4致炎作用的影響 LPS濃度-效應(yīng)的分析發(fā)現(xiàn)，10ng/ml LPS即可以明顯地增加H5V細(xì)胞的IL-6表達(dá)，隨后IL-6的生成隨著LPS濃度的增高而增加，當(dāng)LPS濃度為500ng/ml時(shí)達(dá)到頂峰；時(shí)間-效應(yīng)的分析發(fā)現(xiàn)，1

16、00ng/ml LPS作用3小時(shí)即可以誘導(dǎo)H5V細(xì)胞IL-6的釋放增加，其效應(yīng)隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，在刺激24小時(shí)時(shí)達(dá)到頂峰。 4、C3a和C5a對(duì)其他補(bǔ)體激活物致炎作用的影響 應(yīng)用HLIVEC替代H5V后，發(fā)現(xiàn)了Pam3CSK4和Po]y I：C可以明顯地誘導(dǎo)IL-8表達(dá)，但并未發(fā)現(xiàn)C3a和C5a可以上調(diào)TLRs激活物的致炎作用。 結(jié)論： 1、Pam3CSK4、Poly I：C和LPS可以激活相應(yīng)的