NNMT過表達對大腸癌細胞生物學行為的影響及意義研究.pdf

1、為了降低腫瘤的死亡率或提高治療的效果，許多研究致力于腫瘤關鍵生物標志物的發(fā)現(xiàn)和篩選?；蚪M和蛋白組學等新技術的應用為篩選新的腫瘤標志物或耐藥相關分子提供了新的途徑。尼克酰胺-N-甲基化酶(NNMT, EC2.1.1.1)正是近年用蛋白組學和基因芯片技術比較不同癌組織和癌旁組織差異時發(fā)現(xiàn)的在癌組織中異常表達的蛋白質(zhì)酶。與正常組織和腫瘤旁組織相比，NNMT在結(jié)直腸癌、甲狀腺乳頭狀癌、腎透明細胞癌、口腔鱗狀細胞癌、肺癌、膀胱癌、胃和胰腺等腫瘤

2、組織有過表達，并在多種腫瘤患者的血清中升高。這些研究提示NNMT與腫瘤發(fā)生密切相關，推測NNMT可能參與腫瘤細胞的多種生物功能，與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展有關，或可影響化、放療效果，但對NNMT在腫瘤細胞中的過表達的意義或確切作用仍需細胞學實驗證實。
　　 鑒于大腸癌是嚴重危害人類健康的惡性腫瘤之一，在西方發(fā)達國家，大腸癌死亡率僅次于肺癌居第二位，在我國的惡性腫瘤死因順位中居第三、四位，是我國現(xiàn)階段重點防治的8大癌癥之一，并具有高發(fā)趨勢

3、，我們選擇該腫瘤為本次研究的重點。
　　 目的：研究NNMT對結(jié)直腸癌細胞的生物學功能的影響；研究NNMT在腫瘤中的作用機制或分析其下游相關分子組成的模塊或通路，NNMT與結(jié)直腸癌臨床病理的關系。
　　 方法：
　　 1.通過分子克隆技術構(gòu)建原核表達質(zhì)粒p GEX-4T-2/NNMT和真核表達質(zhì)粒pcDNA3.1/NNMT。
　　 2.利用基因工程制備NNMT蛋白，并作為免疫原免疫小鼠制備NNMT單克隆抗

4、體，并建立基于此單克隆抗體的Western-blot、免疫組化等實驗方法。
　　 3.采用RT-PCR和Westem-blot分析多株結(jié)直腸癌細胞系的NNMT表達，篩選NNMT無/低表達和高表達株。
　　 4.把pcDNA3.1/NNMT轉(zhuǎn)入COLO320和SW480細胞株，用G418來篩選轉(zhuǎn)入目的基因的細胞，建立相應的NNMT高表達腫瘤細胞模型和空質(zhì)粒pcDNA3.1轉(zhuǎn)染的對照模型。
　　 5.通過NNMT高表

5、達腫瘤細胞模型，結(jié)合RNA干擾技術，MTT法分析NNMT對腫瘤細胞生長增殖和化療藥物敏感試驗、流式細胞儀分析凋亡和細胞周期、用Transwell細胞遷移實驗和Matrigel基質(zhì)浸潤實驗研究NNMT對腫瘤細胞遷移和侵潤等生物學功能的影響。
　　 6.用Affimetrix gene expression芯片比較NNMT基因?qū)肭昂蟠竽c癌細胞的基因表達差異，分析NNMT下游效應分子和作用機制。
　　 7.采用免疫組化檢測組

6、織NNMT與結(jié)直腸癌的臨床病理的關系。
　　 結(jié)果：1.構(gòu)建了原核表達質(zhì)粒p GEX-4T-2/NNMT和真核表達質(zhì)粒pcDNA3.1/NNMT,并通過了酶切和測序驗證。
　　 2.利用基因工程制備的NNMT蛋白作為免疫原免疫小鼠制備了能穩(wěn)定分泌抗NNMT單克隆抗體的4個細胞株，該NNMT單克隆抗體具有很好的特異性和反應性，并建立了基于此單克隆抗體的Western-blot、免疫組化等實驗方法。
　　 3.對多株

7、大腸癌細胞系的NNMT的mRNA和蛋白表達進行了分析，RT-PCR結(jié)果顯示除SW480外，其余細胞均能檢測到mRNA，其中COLO320表達水平最高。Western blot結(jié)果也顯示NNMT蛋白在COLO320細胞株表達量最高，其次為HCE8693和HT-29，SW480細胞株表達陰性，SW620、HCT116細胞株表達較弱。
　　 4.建立了相應的NNMT高表達腫瘤細胞模型和空質(zhì)粒pcDNA3.1轉(zhuǎn)染的對照模型。 pcDNA

8、3.1/NNMT轉(zhuǎn)染SW480組NNMT mRNA水平較對照大幅上升，且轉(zhuǎn)染pcDNA3.1/NNMT的SW480細胞NNMT蛋白表達陽性，而對照細胞陰性，提示NNMT基因?qū)氤晒?，并有效表達；轉(zhuǎn)染pcDNA3.1/NNMT的COLO320細胞的NNMT蛋白表達較對照組高約1.621倍，也表明NNMT基因?qū)氤晒?，并有效表達。
　　 5.MTT法檢測了NNMT對細胞增殖的影響：從第72小時開始，轉(zhuǎn)染NNMT基因的細胞株的490n

9、m波長處光吸收值高于對照組，經(jīng)方差分析有統(tǒng)計學差異(p＜0.05)。直接選擇SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY公司的NNMT siRNA(m):sc-61214，在SW480細胞，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pcDNA3.1/NNMT和空載體的SW480細胞進行了初步實驗，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染NNMT基因的細胞株生長增殖能力高于對照組，但可被NNMT特異的siRNA抑制。
　　 6.MTT法檢測NNMT對5-FU和奧沙利鉑的影響。結(jié)果導入NN

10、MT SW480細胞株對5-Fu耐藥性較對照組細胞株強，SW480-pcDNA3.1/NNMT cell的IC50為16.8 mM，SW480-pcDNA3.1和SW480的IC50為8.8，9.2 mM;對奧沙利鉑耐藥性變化不大。
　　 7.對NNMT轉(zhuǎn)染前后SW480細胞進行了Transwell細胞遷移實驗和Matrigel基質(zhì)浸潤實驗。實驗結(jié)果顯示SW480細胞和空載體SW480細胞幾乎無細胞穿過，而pcDNA3.1/NN

11、MT的SW480細胞則約有15-30個每低倍視野。
　　 8.細胞周期結(jié)果顯示SW480細胞，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pcDNA3.1/NNMT和空載體的SW480細胞三組間G1期、G2期和S期的比例差別無統(tǒng)計學意義，在COLO320，COLO320-pcDNA3.1，COLO320-pcDNA3.1/NNMT細胞三組細胞也得到了同樣的結(jié)果。
　　 9.細胞凋亡結(jié)果顯示，SW480細胞組用5-FU的處理誘導24h后的凋亡變化顯示SW48

12、0-pcDNA3.1/NNMT細胞的LR\細胞數(shù)為9.12％，低于對照組15.66％、15.85％，提示NNMT具有抗凋亡功能。COLO320細胞組的凋亡分析結(jié)果也顯示NNMT具有抗凋亡功能，COLO320-pcDNA3.1/NNMT細胞的LR（右下象限）細胞數(shù)為8.90％，低于對照組11.44％、12.57％，UR區(qū)（右上象限）的FITC+/PI+壞死細胞沒有明顯差別。
　　 10.我們用Affimetrix gene exp

13、ression芯片比較NNMT基因?qū)肭昂蟠竽c癌細胞株SW480基因表達差異，根據(jù)pcDNA3.1/NNMT的SW480細胞/SW480細胞，或pcDNA3.1/NNMT的SW480細胞/空載體的SW480細胞的基因表達差異超過2，同時考慮空載體的SW480細胞/SW480細胞，共選出33個候選基因。對上述基因進行GO功能分析發(fā)現(xiàn)具有差異表達的基因主要與物質(zhì)代謝（脂類、糖）、細胞周期、細胞凋亡、細胞增殖調(diào)節(jié)、信號傳導和細胞分化相關。其中

14、上調(diào)的基因主要參與脂類代謝、氧化還原和電子傳遞。
　　 11.對109例原發(fā)灶、26例淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶的腫瘤組織進行了NNMT免疫組化分析，18例(16.5％)原發(fā)灶的腫瘤組織陽性，但淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶的腫瘤組織全陰性；陽性反應主要在腫瘤組織的細胞漿，高分化、低分化和黏液腺癌組織均有病例顯示陽性，癌旁的正常組織陰性，NNMT在結(jié)直腸癌組織的表達與病人的臨床病理因素的相關分析顯示：NNMT的陽性率與腫瘤細胞的分化程度有關，在低分化腺癌中的陽

15、性率為36.4％，高于高中分化腺癌(7.9％)，P＜0.01；NNMT的陽性率在不同年齡、性別、腫瘤的部位、TNM分期、DUKE'S分期組間差別無統(tǒng)計學意義，P＞0.05。
　　 結(jié)論：
　　 1.從正常人肝臟組織中獲得NNMT基因，并構(gòu)建了原核表達質(zhì)粒pGEX-4T-2/NNMT和真核表達質(zhì)粒pcDNA3.1/NNMT；構(gòu)建了SW480-pcDNA3.1，SW480-pcDNA3.1/NNMT，COLO320-pcDN

16、A3.1和COLO320-pcDNA3.1/NNMT等細胞模型；利用基因工程制備的NNMT蛋白可作為免疫原免疫小鼠制備抗體、作為反應抗原建立ELISA或Western-Blot的陽性對照；制備了國內(nèi)首株能穩(wěn)定分泌抗NNMT單克隆抗體的細胞株，并建立了基于此單克隆抗體的Western-blot、免疫組化等實驗方法，為研究NNMT提供了很好的工具。
　　 2.不同大腸癌細胞系的NNMT的mRNA和蛋白表達不一，COLO320細胞株表

17、達量最高，而SW480細胞株表達陰性。NNMT與結(jié)直腸癌的臨床病理分析顯示NNMT的陽性率與腫瘤細胞的分化程度有關，陽性的NNMT主要在低分化腺癌。NNMT的陽性率在不同年齡、性別、腫瘤的部位、TNM分期、DUKES分期組間差別無統(tǒng)計學意義，NNMT的陽性反應主要在腫瘤組織的細胞漿，這符合NNMT是胞漿酶的定位。NNMT對腫瘤的遷移和侵潤的影響，臨床病理結(jié)果和細胞實驗結(jié)果并不一致，需進一步研究。
　　 3.細胞水平實驗研究結(jié)果顯

18、示NNMT可能與腫瘤細胞的生物學功能密切相關：NNMT能促進腫瘤細胞增殖，NNMT量的提高也能促進腫瘤細胞增殖；NNMT能促進腫瘤細胞的遷移和侵襲能力；NNMT能通過某種途徑抗凋亡；NNMT可能影響腫瘤細胞耐藥。
　　 4.共選出33個候選基因，這些具有差異表達的基因主要與物質(zhì)代謝（脂類、糖）、細胞周期、細胞凋亡、細胞增殖調(diào)節(jié)、信號傳導和細胞分化相關。其中上調(diào)的基因主要參與脂類代謝、氧化還原和電子傳遞。我們推測NNMT可通過細胞