過表達CDX2對胃癌細(xì)胞生物學(xué)行為影響的初步研究.pdf

1、背景:胃癌是源于胃黏膜上皮的惡性腫瘤,發(fā)病率居我國惡性腫瘤首位,近年來,大量研究已證實胃癌的發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后是多基因改變的結(jié)果,因此研究胃癌相關(guān)基因及其蛋白改變不僅有助于理解胃癌的發(fā)病機制,而且也可發(fā)現(xiàn)在胃癌診斷和預(yù)后評估中有臨床意義的分子標(biāo)記物。尾型同源盒基因-2(CDX2)是人體中腸道特異性表達的核轉(zhuǎn)錄因子,對腸黏膜上皮細(xì)胞的發(fā)育及其形態(tài)和結(jié)構(gòu)特征的維持具有重要作用。正常情況下CDX2表達于小腸及結(jié)腸上皮細(xì)胞,而在胃黏膜組織中無表達

2、。近年來有研究結(jié)果顯示,CDX2在慢性萎縮性胃炎(CAG)相關(guān)的腸化生、Barrett食管及部分胃癌中有表達,提示其在胃黏膜腸化生及胃癌發(fā)生中可能有重要作用。
　　目的:構(gòu)建人同源基因CDX2真核表達載體,轉(zhuǎn)染人胃癌細(xì)胞BGC-823,研究過表達CDX2基因?qū)ξ赴┘?xì)胞的生物學(xué)行為的影響。方法:日本廣島大學(xué)細(xì)胞Dr. Shuho Semba饋贈pcDNA4/TO/Myc-HisA-CDX2載體質(zhì)粒,從pcDNA4/TO/Myc-Hi

3、sA-CDX2載體質(zhì)粒中擴增目的基因CDX2,克隆到pEGFP-C1中,得到pEGFP-C1-CDX2;脂質(zhì)體介導(dǎo)法瞬時轉(zhuǎn)染pEGFP-C1和pEGFP-C1-CDX2至人胃癌細(xì)胞BGC-823中,G418篩選出陽性克隆后擴大培養(yǎng),RT-PCR和Western Blot技術(shù)檢測各組胃癌細(xì)胞中CDX2基因mRNA和蛋白的表達情況,將挑選出的穩(wěn)定株命名為BGC-823/CDX2細(xì)胞;流式細(xì)胞儀檢測BGC-823細(xì)胞(未轉(zhuǎn)染組)、BGC-82

4、3/EV細(xì)胞(空載體組)和BGC-823/CDX2(轉(zhuǎn)染組)細(xì)胞的凋亡情況,MTT法觀測各組細(xì)胞的增殖情況,細(xì)胞劃痕試驗檢測各組細(xì)胞遷移能力,透射電鏡觀察轉(zhuǎn)染細(xì)胞形態(tài)學(xué)的改變。結(jié)果:(1)成功構(gòu)建真核表達載體pEGFP-C1-CDX2;(2)成功篩選出穩(wěn)定過表達CDX2基因的BGC-823胃癌細(xì)胞,即BGC-823/CDX2細(xì)胞;(3)與BGC-823細(xì)胞和BGC-823/EV細(xì)胞比較,BGC-823/CDX2細(xì)胞中CDX2基因mRNA

5、和蛋白的表達明顯上調(diào);(4)與BGC-823細(xì)胞和BGC-823/EV細(xì)胞比較,BGC-823/CDX2組細(xì)胞在轉(zhuǎn)染72小時后出現(xiàn)了明顯的生長抑制;(5)劃痕實驗顯示:與BGC-823細(xì)胞和BGC-823/EV細(xì)胞比較,BGC-823/CDX2組細(xì)胞的遷移能力降低;(6)與BGC-823細(xì)胞和BGC-823/EV細(xì)胞比較,BGC-823/CDX2組細(xì)胞的凋亡率并無明顯增加(P>0.05)。(7)電鏡結(jié)果顯示,與BGC-823組細(xì)胞相比,