腺病毒介導(dǎo)PTEN基因?qū)Y(jié)腸癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響.pdf

1、目的：結(jié)腸癌是最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率呈逐年增加的趨勢(shì)，在我國(guó)部分地區(qū)已經(jīng)超過直腸癌，從而明顯改變了我國(guó)長(zhǎng)期以來(lái)大腸癌中以直腸癌為主的格局。這種發(fā)病趨勢(shì)與西方發(fā)達(dá)國(guó)家中結(jié)直腸癌的發(fā)病情況趨向一致。目前手術(shù)仍是治療結(jié)腸癌最主要而有效的方法。但是5年生存率一直未有明顯提高。因此，如何改善預(yù)后、提高生存率是亟待解決的問題。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，腫瘤的基因治療取得了明顯的進(jìn)展，越來(lái)越多的基因治療方案獲準(zhǔn)或正在進(jìn)行臨床試驗(yàn)。目前國(guó)際上已經(jīng)有

2、近千項(xiàng)基因治療方案獲準(zhǔn)進(jìn)入臨床試驗(yàn)。抑癌基因在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中所發(fā)揮的特殊作用而使抑癌基因療法成為腫瘤基因治療的重要策略之一。新近發(fā)現(xiàn)的抑癌基因PTEN基因在腫瘤發(fā)生、發(fā)展及其它許多方面發(fā)揮重要的作用。PTEN基因在結(jié)腸癌，尤其是進(jìn)展期結(jié)腸癌中的突變率較高，將其作為結(jié)腸癌基因治療的靶基因可能具有重要的研究?jī)r(jià)值。為此，本課題構(gòu)建攜帶PTEN基因的重組腺病毒載體，體外轉(zhuǎn)染PTEN基因缺失的LoVo細(xì)胞株，觀察PTEN基因重組腺病毒對(duì)結(jié)腸

3、癌細(xì)胞生物學(xué)行為影響，以期為結(jié)腸癌的基因治療提供新的途徑。 方法：第一部分：PTEN基因重組腺病毒的構(gòu)建。分別雙酶切pBP-PTEN質(zhì)粒和pDC315質(zhì)粒，回收并純化PTENcDNA片斷和pDC315質(zhì)粒的大片斷，使二者連接獲得含有PTEN基因的重組穿梭質(zhì)粒載體，酶切鑒定證實(shí)構(gòu)建成功。采用位置特異性重組方法構(gòu)建PTEN基因重組腺病毒載體。用脂質(zhì)體介導(dǎo)pDC315.PTEN和pBHGlox△E1,3Cre共轉(zhuǎn)染293細(xì)胞產(chǎn)生PTE

4、N基因重組腺病毒，經(jīng)293細(xì)胞擴(kuò)增，純化制取高滴度重組腺病毒。以相同的方法擴(kuò)增和純化Ad.LacZ。第二部分：PTEN基因重組腺病毒對(duì)LoVo細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。檢測(cè)Ad.LacZ對(duì)LoVo細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率以確定Ad.PTEN的MOI，WesternBlot檢測(cè)PTEN基因的表達(dá)，MTT法檢測(cè)Ad.PTEN轉(zhuǎn)染后LoVo細(xì)胞生長(zhǎng)的變化，雙層軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)其克隆形成率，流式細(xì)胞術(shù)技術(shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞周期及凋亡的變化，Borden小室

5、實(shí)驗(yàn)檢測(cè)其侵襲運(yùn)動(dòng)能力的變化，WesternBlot檢測(cè)轉(zhuǎn)染前后LoVo細(xì)胞nm23-H1表達(dá)的變化。 結(jié)果：①用位置特異性重組方法成功構(gòu)建了攜帶人PTEN基因的重組腺病毒載體(Ad.PTEN)，其滴度約5×1010pfu/ml；②確定Ad.PTEN對(duì)LoVo細(xì)胞的最佳感染復(fù)數(shù)4為50，并檢測(cè)Ad.PTEN轉(zhuǎn)染LoVo細(xì)胞后各時(shí)相點(diǎn)PTENmRNA及PTEN的表達(dá)，顯示PTEN基因的轉(zhuǎn)錄及翻譯表達(dá)隨轉(zhuǎn)染時(shí)間延長(zhǎng)逐漸增加。③Ad.

6、PTEN轉(zhuǎn)染LoVo細(xì)胞后，可顯著抑制其生長(zhǎng)和增殖，G1期比例顯著增高，細(xì)胞凋亡率明顯增加，克隆形成率明顯降低，侵襲運(yùn)動(dòng)能力下降，nm23-H1表達(dá)水平上調(diào)。 結(jié)論：①應(yīng)用位置特異性重組方法成功構(gòu)建了PTEN基因的重組腺病毒載體Ad.PTEN經(jīng)293細(xì)胞擴(kuò)增、純化后獲得高滴度的重組腺病毒。②Ad.PTEN轉(zhuǎn)染靶細(xì)胞后可穩(wěn)定、顯著的表達(dá)。③Ad.PTEN轉(zhuǎn)染LoVo細(xì)胞后可以明顯抑制LoVo細(xì)胞的生長(zhǎng)，發(fā)生G1期阻滯，細(xì)胞凋亡率增