阿司匹林對缺氧條件下結(jié)腸癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響及機(jī)制研究.pdf

1、目的:探討長期服用阿司匹林對結(jié)直腸癌患者原發(fā)病灶18F-FDG PET/CT顯像及患者臨床預(yù)后的影響。在臨床研究的基礎(chǔ)上，通過模擬缺氧微環(huán)境的體外實驗，探討阿司匹林在缺氧條件下對人結(jié)腸癌細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期、早期凋亡率、遷移和侵襲等生物學(xué)行為的影響，并在分子水平上研究阿司匹林對糖代謝指標(biāo)Glut-1、腫瘤干細(xì)胞標(biāo)記物ALDH-1表達(dá)的影響，并探討相關(guān)的作用機(jī)制，為結(jié)直腸癌的預(yù)防和治療提供新的思路。
　　方法:回顧性分析2008年7月

2、至2013年3月，該院收治的術(shù)前行18F-FDG-PET/CT檢查的結(jié)直腸癌患者84例，根據(jù)術(shù)前阿司匹林服藥史分為阿司匹林組和對照組，分析患者的性別、年齡、腫瘤TNM分期、直徑、分化程度及阿司匹林服用史與SUVmax的關(guān)系，并進(jìn)一步探討上述臨床病理因素與患者無病生存率的關(guān)系，采用Kaplan-Meier法進(jìn)行單因素生存分析，Cox比例風(fēng)險模型進(jìn)行多因素預(yù)后分析。體外實驗部分，利用缺氧小室模擬缺氧微環(huán)境，建立人結(jié)腸癌細(xì)胞株HCT116缺氧

3、培養(yǎng)模型。采用CCK8法檢測定缺氧條件下阿司匹林對HCT116增殖的影響;流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期;Transwell法檢測細(xì)胞遷移和侵襲;流式細(xì)胞術(shù)檢測腫瘤干細(xì)胞標(biāo)記物ALDH1的表達(dá);采用Western Blot和實時熒光定量PCR技術(shù)檢測缺氧條件下阿司匹林對于HCT116細(xì)胞缺氧標(biāo)記物HIF-1α、糖代謝指標(biāo)Glut-1及阿司匹林作用靶點COX-2表達(dá)變化的影響。
　　結(jié)果：結(jié)直腸癌原發(fā)病灶最大徑組別之間的PET/C

4、T SUVmax差異有統(tǒng)計學(xué)意義（＜5cm組11.2±5.03 vs.≥5cm組15.2±6.12），不同腫瘤浸潤深度之間的SUVmax差異有統(tǒng)計學(xué)意義（T1+T2組10.1±4.17 vs.T3+T4組13.63±5.97）。阿司匹林組與對照組相比，具有較低的SUVmax值(阿司匹林組9.74±2.62 vs.對照組13.91±6.18)。阿司匹林組的1、2年的無病生存率分別為94％和80％，對照組1、2年的無病生存率分別為86％和7

5、3％，二者有統(tǒng)計學(xué)差異。體外實驗，在利用缺氧小室模擬腫瘤缺氧微環(huán)境研究阿司匹林對人結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116生物學(xué)行為影響的研究中，CCK-8法結(jié)果提示缺氧對HCT116細(xì)胞的生長抑制作用并不明顯，而在缺氧條件給予阿司匹林干預(yù)可明顯抑制細(xì)胞的生長。我們同時發(fā)現(xiàn)，常氧條件下培養(yǎng)48小時后HCT116細(xì)胞的早期凋亡率為6.44±0.42％，單純?nèi)毖?8小時組和缺氧聯(lián)合阿司匹林48小時組的早期凋亡率分別為1.65±0.67％和2.65±0.45％

6、，結(jié)果表明缺氧可抑制HCT116細(xì)胞早期凋亡率，而阿司匹林干預(yù)后可增加早期凋亡率。細(xì)胞周期方面:常氧組、單純?nèi)毖踅M及缺氧聯(lián)合阿司匹林組HCT116細(xì)胞的G0/G1期細(xì)胞比例分別為35.29±0.42％，45.92±0.67％及39.81±0.45％。S期細(xì)胞比例分別為48.19±0.45％、52.74±0.49％及48.91±0.09％。G2/M期細(xì)胞比例分別為16.52±0.48％、1.32±0.22％及11.2±0.54％，結(jié)果表明

7、缺氧可誘導(dǎo)HCT116細(xì)胞周期阻滯于G0/G1期，而阿司匹林干預(yù)后可抑制缺氧誘導(dǎo)的G0/G1細(xì)胞周期阻滯。同樣條件下，我們繼續(xù)探討阿司匹林對于缺氧誘導(dǎo)的腫瘤干細(xì)胞標(biāo)記物ALDH-1表達(dá)的影響，利用分選比例結(jié)合CCK8檢測的OD值，結(jié)果顯示阿司匹林可下調(diào)缺氧誘導(dǎo)的ALDH-1+細(xì)胞相對活力數(shù)，常氧、缺氧及缺氧聯(lián)合阿司匹林48小時組ALDH-1+細(xì)胞的OD值分別為0.19、0.15及0.12。利用Transwell模型評估腫瘤細(xì)胞的遷移和侵

8、襲能力的研究中，結(jié)果提示阿司匹林可下調(diào)缺氧誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲能力。我們還利用Western Blot和實時熒光定量PCR檢測阿司匹林對于缺氧誘導(dǎo)的Glut-1表達(dá)的影響，結(jié)果顯示阿司匹林可下調(diào)缺氧誘導(dǎo)的Glu-1的表達(dá)。為進(jìn)一步探討阿司匹林的作用靶點，結(jié)果顯示缺氧可誘導(dǎo)HCT116細(xì)胞COX-2在蛋白和mRNA水平的表達(dá)，早期阿司匹林干預(yù)則可下調(diào)COX-2的表達(dá)。
　　結(jié)論：臨床研究部分結(jié)果提示結(jié)直腸癌原發(fā)病灶的SUVma

9、x與腫瘤的直徑大小和浸潤深度呈正相關(guān)，而與長期服用阿司匹林呈負(fù)相關(guān)。生存分析結(jié)果提示診斷結(jié)直腸癌前長期服用阿司匹林可改善患者的無病生存率。體外研究結(jié)果提示:在人結(jié)腸癌細(xì)胞株HCT116，缺氧可誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞周期停滯于G0/G1期，減少腫瘤細(xì)胞的早期凋亡，增加遷移和侵襲能力。隨著缺氧時間的延長， HCT116中ALDH-1陽性細(xì)胞相對活力數(shù)有所增加。同時缺氧可上調(diào)結(jié)腸癌細(xì)胞葡萄糖代謝相關(guān)載體Glut-1在蛋白和mRNA水平的表達(dá)。阿司匹林