人工誘導(dǎo)雞性反轉(zhuǎn)及雞性別決定遺傳機(jī)制研究.pdf

1、雞的性別決定與分化過(guò)程與哺乳動(dòng)物存在很大差別，容易受到性激素變化的影響。自然條件下的性反轉(zhuǎn)現(xiàn)象在歷史上早有記載。由于性反轉(zhuǎn)雞是研究鳥(niǎo)類(lèi)性別決定與分化的理想材料，因此近年來(lái)研究者們嘗試?yán)酶鞣N方法誘導(dǎo)產(chǎn)生性反轉(zhuǎn)雞來(lái)對(duì)這一機(jī)制進(jìn)行研究。本課題以伴性矮小型雞為研究對(duì)象，在雞胚性別決定和分化的關(guān)鍵時(shí)期注入芳香化酶抑制劑-Fadrozole和Letrozole，干擾雌激素正常合成，人工誘導(dǎo)了雞的性反轉(zhuǎn)。應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)性反轉(zhuǎn)和對(duì)照組雞胚

2、性腺中性別決定候選基因的表達(dá)時(shí)間及表達(dá)量差異，結(jié)合前人已有試驗(yàn)數(shù)據(jù)，初步構(gòu)建了雞性別決定和分化的路徑圖；追蹤了試驗(yàn)組雞只體內(nèi)性激素水平變化對(duì)其生長(zhǎng)發(fā)育的影響；在性反轉(zhuǎn)雞成年后，根據(jù)其生殖生理機(jī)能的變化，結(jié)合胚胎期性別決定候選基因表達(dá)的數(shù)據(jù)，對(duì)雞性別決定機(jī)制的特點(diǎn)進(jìn)行了探討。最后，為了分析造成性反轉(zhuǎn)雞可育的真正原因，采用孟德?tīng)柗蛛x群體設(shè)計(jì)，構(gòu)建了遺傳背景相同而表型差異顯著的試驗(yàn)雞群，對(duì)伴性矮小型雞與普通型雞GH、IGF-1分泌水平的差異和

3、生長(zhǎng)激素受體突變對(duì)伴性矮小型公雞繁殖力的影響進(jìn)行了研究。結(jié)果表明： 1) 將1mg非甾體類(lèi)芳香化酶抑制劑Fadrozole注入孵化3.5天的雞胚，成功誘導(dǎo)遺傳性別為雌性的個(gè)體表觀性別反轉(zhuǎn)為雄性。試驗(yàn)組獲得的104只性反轉(zhuǎn)雞在成年后剖檢發(fā)現(xiàn)，生殖系統(tǒng)發(fā)生部分或完全雄性化。Fadrozole處理對(duì)個(gè)體生長(zhǎng)沒(méi)有影響。另一種非甾體類(lèi)芳香化酶抑制劑Letrozole 0.1mg處理無(wú)法誘導(dǎo)個(gè)體發(fā)生性反轉(zhuǎn)，試驗(yàn)組母雞僅在4-10周齡表現(xiàn)出非

4、典型的雄性第二性征，成年后則發(fā)育為正常母雞。Letrozole對(duì)伴性矮小型雞8周齡脛長(zhǎng)及各生長(zhǎng)階段增重影響均不顯著(P>0.05)。 2) 以Fadrozole處理組雞胚為試驗(yàn)材料，本研究檢測(cè)了雞性別決定候選基因DMRT1、PKCIW和FET1的表達(dá)變化。在整個(gè)性別決定關(guān)鍵時(shí)期(E4.5～E10.5)，DMRT1在雄性的表達(dá)量顯著高于雌性(P<0.05)，并且在ZW性反轉(zhuǎn)雞胚中表達(dá)大幅上升，表咀DMRT1的上調(diào)表達(dá)與睪丸形成是相

5、關(guān)的。PKCIW基因在雌性特異表達(dá)并在性反轉(zhuǎn)雞胚中表達(dá)上升，這可能與其特殊作用模式相關(guān)，但即便性反轉(zhuǎn)雞胚中PKCIW達(dá)代償性升高，也未能阻止ZW性反轉(zhuǎn)個(gè)體性腺發(fā)育為睪丸。FET1為雌性特異表達(dá)，但在性反轉(zhuǎn)雞胚中表達(dá)無(wú)變化。本試驗(yàn)結(jié)果支持DMRT1是雞睪丸決定因子的假說(shuō)。 3) 通過(guò)觀測(cè)成年性反轉(zhuǎn)雞生殖機(jī)能的變化，本試驗(yàn)首次發(fā)現(xiàn)2只可育的性反轉(zhuǎn)雞，它們不僅具有雄性第二性征，并且可以產(chǎn)生精液、繁育正常的后代。2只性反轉(zhuǎn)雞精液中精子密

6、度很低，分別為12.2和14.6億/mL；精液中存在大量畸形精子，占到精子總數(shù)的79％和69％：但人工授精后仍獲得正常后代，入孵蛋孵化率分別為5.6％和22.4％。本試驗(yàn)使用FISH技術(shù)在性反轉(zhuǎn)雞精液中檢測(cè)到W精子，并利用快慢羽雜交試驗(yàn)證實(shí)了W精子具有正常的受精能力。因此，精子細(xì)胞的分化發(fā)育主要取決于睪丸中的支持細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞，而與其自身遺傳物質(zhì)無(wú)關(guān)。測(cè)定性反轉(zhuǎn)個(gè)體的血清性激素濃度發(fā)現(xiàn)，可育性反轉(zhuǎn)雞的雄激素水平上升，而雌激素下降，但與不

7、可育性反轉(zhuǎn)個(gè)體差異不顯著(P>0.05)。本試驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明血清性激素水平只能部分反映個(gè)體的性反轉(zhuǎn)程度，而不是造成可育性反轉(zhuǎn)的主要因素。 4) 為了尋找造成性反轉(zhuǎn)雞可育的真正原因，本研究分析了伴性矮小型公雞及其全同胞普通型公雞GH、IGF-1分泌水平的差異和伴性矮小基因?qū)π坌陨车挠绊?。結(jié)果顯示，伴性矮小型公雞生長(zhǎng)受伴性矮小基因影響，成年體重比普通型個(gè)體低36.4％。但其生殖功能正常，30周齡的各項(xiàng)精液品質(zhì)指標(biāo)，包括精液體積，精子密

8、度，活力，活率，酸堿度和畸形精子數(shù)均與普通型公雞無(wú)異。伴性矮小型公雞受精率95.2％，普通型個(gè)體92.4％。檢測(cè)血清和精清中GH和IGF-1濃度后發(fā)現(xiàn)，‘伴性矮小型公雞血清和精清中的GH含量顯著高于普通型公雞(P<0.05)；伴性矮小型公雞血清IGF-1極低，但精清IGF-1濃度與其全同胞普通型公雞相近。GHR缺失不影響伴性矮小型公雞的生殖功能，因此，伴性矮小型性反轉(zhuǎn)雞的可育性似乎是其睪丸組織內(nèi)GH和IGF-1功能模式與普通型性反轉(zhuǎn)雞不