多模態(tài)成像納米粒子和探針的研制及靶向hTfR成像的基礎(chǔ)研究.pdf

1、分子影像學(xué)是采用影像學(xué)技術(shù)無(wú)創(chuàng)性地對(duì)活體內(nèi)參與生理或病理過(guò)程的分子進(jìn)行可視化檢測(cè)，活體狀態(tài)下對(duì)分子、基因和細(xì)胞的變化進(jìn)行定性和定量研究的一門(mén)科學(xué)。磁共振成像(MRI)、活體光學(xué)成像及核素顯像是該領(lǐng)域的三大主體技術(shù)。核素顯像有一定的輻射損傷，觀察時(shí)間有限，應(yīng)用受限。MRI和活體光學(xué)成像，尤其是近年來(lái)發(fā)展迅速的近紅外熒光(NIRF)成像更為安全，在疾病的早期診斷和靶向治療、干細(xì)胞的標(biāo)記與活體示蹤等方面應(yīng)用越來(lái)越廣泛。MRI具有時(shí)間和空間分辨

2、率高、解剖定位準(zhǔn)確的優(yōu)勢(shì)，而敏感性相對(duì)不足，光學(xué)成像雖穿透深度有限，空間定位較差，但卻具實(shí)時(shí)成像、敏感性高等優(yōu)點(diǎn)。多模態(tài)成像策略，即多種成像模式的結(jié)合與優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)，可解決單一技術(shù)的缺陷，是分子影像學(xué)未來(lái)的發(fā)展方向。制備安全性高、生物相容性好的多功能納米材料及靶向性能高的分子探針是實(shí)現(xiàn)活體多模態(tài)成像的有力手段之一，也是目前分子影像學(xué)的研究熱點(diǎn)。
　　 第一章磁性-熒光量子點(diǎn)雙功能納米粒子雙標(biāo)記rMSCs
　　 目的：

3、　　 制備磁性-熒光量子點(diǎn)雙功能納米粒子，一步雙標(biāo)記大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(rMSCs)，評(píng)價(jià)雙功能納米粒子對(duì)rMSCs的標(biāo)記效率、可行性和安全性，探討其用于MRI和光學(xué)多模態(tài)成像的應(yīng)用價(jià)值。
　　 方法：
　　 1.利用二氧化硅(SiO2)同時(shí)包裹四氧化三鐵(Fe3O4)和碲化鎘(CdTe)，制備磁性-熒光量子點(diǎn)雙功能納米粒子Fe3O4@CdTe@SiO2。
　　 2.使用透射電鏡、振動(dòng)磁強(qiáng)計(jì)和紫外激發(fā)燈等對(duì)納

4、米粒子的粒徑、分布、飽和磁化強(qiáng)度和熒光性能等進(jìn)行表征。
　　 3.通過(guò)密度梯度離心+貼壁法獲取rMSCs，體外傳代、培養(yǎng)，并通過(guò)慢病毒感染將增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(EGFP)基因轉(zhuǎn)導(dǎo)入rMSCs基因組，使其持續(xù)穩(wěn)定表達(dá)EGFP。
　　 4.利用鐵濃度為25μg/mL的Fe3O4@CdTe@SiO2與rMSCs共同孵育，通過(guò)熒光顯微鏡和普魯士藍(lán)染色觀察細(xì)胞內(nèi)雙功能納米粒子，檢測(cè)雙標(biāo)記效率，分光光度計(jì)測(cè)量細(xì)胞鐵含量。以未標(biāo)記的r

5、MSCs作為對(duì)照。
　　 5.采用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞毒性和增殖能力，臺(tái)盼藍(lán)拒染測(cè)細(xì)胞活力，成骨、成脂誘導(dǎo)檢測(cè)細(xì)胞多向分化能力，評(píng)價(jià)雙標(biāo)記對(duì)rMSCs生物學(xué)特性的影響。熒光顯微鏡和普魯士藍(lán)染色觀察誘導(dǎo)分化后Fe3O4@CdTe@SiO2雙標(biāo)記情況。
　　 6.雙標(biāo)記后的rMSCs分成不同數(shù)量級(jí)(3×106-1×103個(gè))，使用臨床1.5T MR掃描儀進(jìn)行SE T1WI、FSE T2WI和GRE T2*WI成像，測(cè)量T2W

6、I和T2*WI不同數(shù)量級(jí)細(xì)胞的信噪比(SNR)，觀察細(xì)胞數(shù)量與MRI信號(hào)變化的關(guān)系。
　　 結(jié)論：
　　 1.殼核結(jié)構(gòu)的Fe3O4@CdTe@SiO2納米粒子具有超順磁性和熒光雙重特性，可同時(shí)對(duì)rMSCs進(jìn)行磁性和熒光雙標(biāo)記，標(biāo)記效率高，持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)，細(xì)胞毒性低，對(duì)rMSCs的生物學(xué)特性無(wú)明顯影響，在體外誘導(dǎo)分化過(guò)程中細(xì)胞內(nèi)納米粒子的熒光和超順磁性仍可持續(xù)3周以上。
　　 2.1.5TMR掃描儀可檢測(cè)到Fe3O4@

7、CdTe@SiO2雙標(biāo)記后細(xì)胞的信號(hào)變化程度與數(shù)量級(jí)間存在相關(guān)性，有望為MRI和光學(xué)多模態(tài)成像示蹤移植后rMSCs提供技術(shù)基礎(chǔ)。
　　 第二章磁性-近紅外雙功能探針的構(gòu)建及HeLa細(xì)胞和hMSCs體外多模態(tài)靶向成像
　　 目的：
　　 構(gòu)建人轉(zhuǎn)鐵蛋白(Tf)介導(dǎo)的磁性-近紅外熒光(NIRF)雙功能分子探針，靶向標(biāo)記高表達(dá)hTfR的腫瘤細(xì)胞(HeLa)和人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(hMSCs)，探討MRI和NIRF多模態(tài)h

8、TfR靶向成像及對(duì)hMSCs靶向示蹤的可行性。
　　 方法：
　　 1.將Tf與NIRF染料cy5.5通過(guò)羧氨反應(yīng)結(jié)合，制備Tf-cy5.5，在EDC/sulfo-NHS的催化下，進(jìn)一步與超順磁性的氧化鐵(IO)相連接，構(gòu)建磁性-NIRF雙功能分子探針Tf-cy5.5-IO。以人血清白蛋白(HSA)作為對(duì)照蛋白，構(gòu)建對(duì)照粒子HSA-cy5.5-IO。
　　 2.通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳、蛋白-核酸分析儀全波長(zhǎng)掃描吸收譜

9、分析、粒度與Zeta電位分析儀以及透射電鏡等確定Tf-cy5.5-IO連接效率，對(duì)其粒徑、分布與Zeta電位等理化特性進(jìn)行表征。
　　 3.通過(guò)慢病毒感染將人源化綠色熒光蛋白(hrGFP)基因轉(zhuǎn)導(dǎo)入hMSCs，使其持續(xù)穩(wěn)定表達(dá)hrGFP。Balb/c裸鼠皮下注射5×106個(gè)慢病毒感染后的hMSCs，觀察其致瘤性，以等量HeLa皮下注射作為對(duì)照。
　　 4.將表達(dá)hTfR的HeLa細(xì)胞和hMSCs分為4組，即A、未標(biāo)記細(xì)胞

10、組；B、靶向探針組；C、HSA對(duì)照組和D、競(jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn)組，對(duì)各組細(xì)胞進(jìn)行激光共聚焦掃描、普魯士藍(lán)染色、細(xì)胞鐵含量測(cè)定及流式細(xì)胞儀檢測(cè)，驗(yàn)證Tf-cy5.5-IO對(duì)hTfR的靶向性。
　　 5.取各組2×105個(gè)HeLa細(xì)胞和hMSCs，進(jìn)行體外細(xì)胞MRI和NIRF成像，定量檢測(cè)R2值和平均熒光強(qiáng)度值的變化率，評(píng)價(jià)Tf-cy5.5-IO用于HeLa和hMSCs靶向多模態(tài)成像的可行性。
　　 6.采用CCK-8法檢測(cè)Tf-cy5

11、.5-IO對(duì)兩種細(xì)胞的細(xì)胞毒性及對(duì)hMSCs增殖能力的影響，臺(tái)盼藍(lán)拒染法測(cè)細(xì)胞活力，碘化吡啶法測(cè)細(xì)胞凋亡和周期，對(duì)hMSCs進(jìn)行成骨、成脂和成軟骨誘導(dǎo)檢測(cè)細(xì)胞多向分化能力，評(píng)價(jià)雙功能探針對(duì)靶細(xì)胞生物學(xué)特性的影響。
　　 7.將探針標(biāo)記后的第5代hMSCs、成骨和成脂誘導(dǎo)后的hMSCs分別分為上述4組，進(jìn)行MRI和NIRF成像，驗(yàn)證Tf-cy5.5-IO對(duì)標(biāo)記或分化后hMSCs的靶向性。
　　 8.Balb/c小鼠尾靜脈注

12、射Tf-cy5.5-IO后連續(xù)飼養(yǎng)10d，對(duì)小鼠進(jìn)行一般情況觀察、肝腎功能測(cè)定和病理學(xué)檢查，評(píng)價(jià)探針對(duì)活體小動(dòng)物的急性毒性作用。
　　 結(jié)論：
　　 1.Tf-cy5.5-IO分子探針具有磁性和NIRF雙重特性，能夠特異性識(shí)別hTfR靶分子，通過(guò)MRI和NIRF成像可實(shí)現(xiàn)對(duì)高表達(dá)hTfR的HeLa細(xì)胞和hMSCs體外多模態(tài)靶向成像。
　　 2.探針的細(xì)胞毒性低，對(duì)腫瘤細(xì)胞和干細(xì)胞生物學(xué)特性未產(chǎn)生負(fù)面影響，小鼠活體

13、內(nèi)應(yīng)用顯示雙功能探針的生物相容性好，無(wú)明顯急性毒性作用。
　　 3.在體外，利用Tf-cy5.5-IO雙功能探針，能夠?qū)MSCs進(jìn)行靶向成像，探針對(duì)標(biāo)記后第5代和誘導(dǎo)分化后的hMSCs仍具有靶向性。
　　 第三章hTfR體外多模態(tài)成像及QPCR對(duì)照研究
　　 目的：
　　 對(duì)不同hTfR表達(dá)水平的細(xì)胞進(jìn)行MRI-NIRF多模態(tài)成像，與熒光實(shí)時(shí)定量PCR(QPCR)檢測(cè)所得hTfR靶基因表達(dá)情況進(jìn)行對(duì)照研

14、究，客觀評(píng)價(jià)Tf-cy5.5-IO探針靶向hTfR成像靈敏度。
　　 方法：
　　 1.收集HeLa、hMSCs、U251和HepG2四種細(xì)胞，提取基因組RNA，通過(guò)QPCR檢測(cè)hTfR基因表達(dá)的相對(duì)水平。
　　 2.Tf-cy5.5-IO探針與四種細(xì)胞以相同濃度共同孵育1h后，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞cy5.5的平均熒光強(qiáng)度，每種細(xì)胞均設(shè)未標(biāo)記細(xì)胞組和等量HSA-cy5.5-IO對(duì)照粒子組作為對(duì)照。
　　 2

15、.等量Tf-cy5.5-IO與四種細(xì)胞共同孵育4h后進(jìn)行細(xì)胞的MRI和NIRF成像，定量檢測(cè)其R2值和平均熒光強(qiáng)度值的變化率，與QPCR結(jié)果對(duì)照分析。
　　 結(jié)論：
　　 1.Tf-cy5.5-IO分子探針與hTfR結(jié)合進(jìn)行MRI-NIRF靶向成像，在一定程度上可定量反映細(xì)胞hTfR基因的表達(dá)水平。
　　 2.hMSCs相對(duì)高表達(dá)hTfR，且MRI-NIRF多模態(tài)靶向成像具有可視性和定量檢測(cè)能力，為進(jìn)一步開(kāi)展hM