益生菌VSL#3對大鼠實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎療效及作用機(jī)制的研究.pdf

1、炎癥性腸病(Inflammatory bowel disease,IBD)是一種病因尚不十分清楚的慢性非特異性腸道炎癥性疾病,包括潰瘍性結(jié)腸炎(Ulcerative colitis,UC)和克羅恩病(Crohn's disease,CD),本病在西方國家相當(dāng)常見,近年來我國IBD的患病人數(shù)呈明顯上升趨勢,主要是UC患病人數(shù)劇增。UC病變主要累及大腸粘膜及粘膜下層,多于直腸起始,可逆行發(fā)展,呈連續(xù)性分布,表現(xiàn)為腹痛、腹瀉、粘液膿血便,本病

2、往往病程較長,且易反復(fù)發(fā)作,嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量,該病已經(jīng)被世界衛(wèi)生組織列為難治疾病之一。因此,闡明該病的病因及發(fā)病機(jī)制,并尋求有效的治療方法成為近年研究的熱點(diǎn)之一。
　　 動(dòng)物模型對于研究其病因、發(fā)病機(jī)制、治療手段以及新藥的研發(fā)均具有重要意義,正確選擇適合研究目的的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型至關(guān)重要。本研究主要探討幾種化學(xué)藥物誘導(dǎo)結(jié)腸炎模型的造模效果,包括葡聚糖硫酸鈉(Dextran sulphate sodium,DSS)造模法、三硝基

3、苯磺酸(2,4,6-trinitrobenzene sulfonic acid,TNBS)造模法、惡唑酮(Oxazolone,OXZ)造模法。本研究旨在對比常見的幾種化學(xué)誘導(dǎo)結(jié)腸炎的方法,選擇最佳的造模方法繼續(xù)發(fā)病機(jī)制及治療方面的研究。
　　 目的：通過外源性化學(xué)藥物誘導(dǎo)結(jié)腸炎的方法建立大鼠實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎模型,選擇最佳的造模方法繼續(xù)發(fā)病機(jī)制及治療方面的研究。比較益生菌VSL＃3與傳統(tǒng)治療藥物美沙拉嗪治療大鼠急、慢性實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎的療

4、效,檢測與實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎發(fā)病密切相關(guān)的IL-6、IL-23、TGF-β、STAT3、P-STAT3細(xì)胞因子與信號因子的表達(dá),研究其治療的作用機(jī)制,評價(jià)益生菌VSL＃3治療實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎的療效。檢索文獻(xiàn)后完成薈萃分析,對益生菌治療潰瘍性結(jié)腸炎進(jìn)行系統(tǒng)評價(jià)。
　　 方法：32只SD大鼠隨機(jī)分為四組,正常對照組(A)、DSS組(B)、TNBS組(C)、Oxazolone組(D),每組8只。實(shí)驗(yàn)期間每日觀察大鼠飲食,活動(dòng)等一般情況,監(jiān)測體重

5、,觀察糞便性狀及有無隱血,通過疾病活動(dòng)指數(shù)(Disease activity index,DAI)以及大鼠大腸粘膜組織損傷評估大鼠結(jié)腸炎嚴(yán)重程度,選擇最佳造模方法進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。通過第一部分的實(shí)驗(yàn)研究,選擇葡聚糖硫酸鈉造模方法進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。56只SD大鼠采用隨機(jī)抽簽的方法分為7組,每組8只,分別為E組-K組。文獻(xiàn)中依據(jù)大鼠的體表面積給藥劑量分別為VSL＃3:0.6g/(kg/d)、美沙拉嗪:0.4g/(kg/d),于實(shí)驗(yàn)第八天開始給藥

6、,每日灌胃1次,連續(xù)灌胃1周。E組:正常組;F組:模型組;G組:生理鹽水組:造模+NS(0.2ml/10g)灌胃;H組:造模+0.4g/(kg/d)美沙拉嗪灌胃;Ⅰ組:造模+0.6g/(kg/d)VSL＃3灌胃;J組:造模+0.6g/(kg/d)熱滅活VSL＃3灌胃;K組:造模+0.6g/(kg/d)VSL＃3+0.4g/(kg/d)美沙拉嗪灌胃;實(shí)驗(yàn)期間觀察指標(biāo)以及標(biāo)本采集、處理與第一部分基本相同。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物大腸標(biāo)本行Real-time

7、 PCR、Western blotting、免疫組化技術(shù)檢測細(xì)胞因子。葡聚糖硫酸鈉造模法進(jìn)行大鼠慢性實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎方面的研究。56只SD大鼠采用隨機(jī)抽簽的方法分為7組,每組8只進(jìn)行造模,分別為L組-R組,干預(yù)方式分別與E組-K組相同。實(shí)驗(yàn)期間觀察指標(biāo)以及標(biāo)本采集、處理、檢測指標(biāo)等與第一部分基本相同。檢索MEDLINE、EMBASE、The Cochrane Controlled Trials Register。評價(jià)益生菌治療與非益生菌治療

8、在潰瘍性結(jié)腸炎誘導(dǎo)緩解、維持治療方面的療效。
　　 結(jié)果：B組、C組及D組大鼠先后出現(xiàn)不同程度的毛色干枯、精神欠活躍、反應(yīng)欠靈活、食量減少,倦怠懶動(dòng)、拱背、拖尾、腹瀉、粘液血便、體重減輕等癥狀。A組DAI評分無明顯變化,B組、C組及D組大鼠DAI評分進(jìn)行性升高,且第五、六、七天DAI評分升高幅度較快。第七天時(shí)DAI評分由高到低依次為D組＞C組＞B組＞A組,B、C、D組與A組比較有顯著性差異。C組與D組無顯著性差異,B組與C、D組

9、比較有顯著性差異。B、C、D組組織學(xué)損傷均較為明顯,組織學(xué)損傷嚴(yán)重程度由重至輕依次為C、D、B組,C組與B組比較有顯著性差異。
　　 DSS組、OXZ組病變與人類UC類似,而TNBS組與CD病變類似,DSS組在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中無大鼠出現(xiàn)死亡,而TNBS組及OXZ組均有兩只大鼠出現(xiàn)死亡。
　　 益生菌對急性大鼠實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎療效結(jié)果:模型組和NS組大鼠一般狀態(tài)最差,部分大鼠出現(xiàn)粘液膿血便或血便,正常組大鼠無異常表現(xiàn),其余單藥治

10、療組大鼠一般狀態(tài)介于正常組與模型組之間,聯(lián)合治療組大鼠一般狀態(tài)與正常組大鼠無明顯差異。
　　 大鼠造模成功后,予以藥物治療七天,結(jié)果示:正常組大鼠在實(shí)驗(yàn)過程中體重逐漸增加,其余各組大鼠體重均呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢,體重下降程度由輕到重依次為聯(lián)合治療組、益生菌組、美沙拉嗪組、熱滅活組、模型組、NS組。益生菌組、美沙拉嗪組、熱滅活益生菌組無明顯差異,聯(lián)合治療組與各單藥治療組比較有顯著性差異。
　　 大鼠大腸外觀及長度變化比較:正

11、常組大鼠結(jié)腸顏色呈淡紅色,腸腔內(nèi)糞便成形,模型組及NS組大鼠結(jié)腸外觀充血,腸腔內(nèi)大便多為不成形稀便,飲用DSS溶液的大鼠大腸腸壁不同程度變薄,大腸長度不同程度縮短,各組大鼠大腸縮短程度由重到輕依次為NS組、模型組、熱滅活VSL＃3組、VSL＃3組、美沙拉嗪組、聯(lián)合治療組。熱滅活VSL＃3組、VSL＃3組、美沙拉嗪組之間無顯著性差異,聯(lián)合治療組療效最佳,與單藥治療組比較有顯著性差異。DAI評分:在給予治療藥物干預(yù)的七天期間,第一天至第四天

12、各組的DAI評分均緩慢降低,各組之間的評分均無顯著性差異。自第五天起,各組之間的DAI評分逐漸出現(xiàn)顯著性差異。第七天時(shí)DAI評分由高到低依次為模型組、NS組、VSL＃3組、滅活VSL＃3組、美沙拉嗪組、聯(lián)合治療組。VSL＃3組、滅活VSL＃3組、美沙拉嗪組評分明顯低于模型組,但三種藥物治療組之間的DAI評分并無顯著性差異,聯(lián)合治療組DAI評分最低,明顯低于單藥治療組,有顯著性差異。
　　 大鼠組織學(xué)損傷評分:組織學(xué)損傷評分由高到

13、低依次為NS組、模型組、VSL＃3組、美沙拉嗪組、滅活VSL＃3組、聯(lián)合治療組、正常組。聯(lián)合治療組大腸組織學(xué)損傷最輕,療效優(yōu)于單藥治療,有顯著性差異。
　　 應(yīng)用Real-Time PCR及Western Blotting兩種方法檢測IL-23、IL-6、TGFβ三種細(xì)胞因子,mRNA水平與蛋白質(zhì)水平均為模型組表達(dá)量最高,NS組表達(dá)量次之,但兩者之間無顯著性差異。美沙拉嗪組較模型組有明顯降低,VSL＃3組與熱滅活VSL＃3組三種

14、細(xì)胞因子的表達(dá)量與美沙拉嗪組比較均無顯著性差異。聯(lián)合治療組的表達(dá)量明顯低于單藥治療組。
　　 細(xì)胞分化相關(guān)的信號因子:STAT3與P-STAT3以上兩項(xiàng)指標(biāo)的mRNA水平、蛋白質(zhì)水平及免疫組化IOD顯示:模型組表達(dá)量最高,NS組表達(dá)量次之,但兩者之間無顯著性差異。美沙拉嗪組較模型組有明顯降低,VSL＃3組、熱滅活VSL＃3治療組STAT3與P-STAT3的表達(dá)量與美沙拉嗪組比較均無顯著性差異,聯(lián)合治療組的表達(dá)量最低,顯著低于單藥

15、治療組。
　　 益生菌對大鼠慢性實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎療效:結(jié)果示在造模過程中各組大鼠一般狀態(tài)逐漸變差。造模成功后予以干預(yù)治療一周,聯(lián)合治療組大鼠一般狀態(tài)好于單藥治療組,但仍不及正常組大鼠。
　　 大鼠慢性結(jié)腸炎造模成功后,予以藥物治療的七天內(nèi),結(jié)果示:正常組大鼠在實(shí)驗(yàn)過程中體重逐漸增加,其余各組大鼠體重均呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢,體重下降程度由輕到重依次為聯(lián)合治療組、益生菌組、美沙拉嗪組、熱滅活益生菌組、模型組、NS組。聯(lián)合治療組體重

16、下降最少,與單藥治療組比較有顯著性差異。
　　 大鼠大腸外觀及長度變化比較:正常組大鼠結(jié)腸顏色呈淡紅色,腸腔內(nèi)糞便成形,模型組及NS組大鼠結(jié)腸外觀充血,腸腔內(nèi)大便多為不成形稀便,飲用DSS溶液的大鼠腸壁不同程度變薄,大腸長度不同程度縮短,各組大鼠大腸縮短程度由重到輕依次為NS組、模型組、滅活VSL＃3組與VSL＃3組、美沙拉嗪組、聯(lián)合治療組。滅活VSL＃3組、VSL＃3組、美沙拉嗪組對大鼠大腸縮短有明顯的改善,各組之間無明顯差異

17、,聯(lián)合治療組大腸縮短最少,與單藥治療組比較有顯著性差異。
　　 DAI評分:第一天至第四天各組的DAI評分均緩慢降低,但各組之間的評分均無顯著性差異。自第五天起,各組之間的DAI評分逐漸出現(xiàn)顯著性差異。第七天時(shí)DAI評分由高到低依次為模型組、NS組、VSL＃3組、滅活VSL＃3組、美沙拉嗪組、聯(lián)合治療組,模型組與NS組DAI評分無顯著性差異,VSL＃3組、滅活VSL＃3組、美沙拉嗪組評分明顯低于模型組,但三種藥物之間的DAI評分

18、并無顯著性差異,聯(lián)合治療組DAI評分最低,明顯低于單藥治療組,有顯著性差異。
　　 大鼠組織學(xué)損傷評分:正常組大鼠大腸組織學(xué)損傷評分為零,其余六組大鼠大腸組織學(xué)出現(xiàn)不同程度的損傷,組織學(xué)損傷評分由高到低依次為:NS組、模型組、美沙拉嗪組、VSL＃3組、滅活VSL＃3組、VSL＃3+美沙拉嗪組。VSL＃3組、美沙拉嗪組和滅活VSL＃3組無顯著性差異。美沙拉嗪與VSL＃3聯(lián)合治療組與各單藥治療組比較有顯著性差異。
　　 細(xì)胞

19、因子:IL-23、IL-6、TGFβ。
　　 應(yīng)用Real-Time PCR及Western Blotting兩種方法檢測的以上三種細(xì)胞因子,mRNA水平與蛋白質(zhì)水平均為模型組表達(dá)量最高,NS組表達(dá)量次之,但兩者之間無顯著性差異。美沙拉嗪組較模型組有明顯降低,VSL＃3組、熱滅活VSL＃3治療組三種細(xì)胞因子的表達(dá)量與美沙拉嗪組比較均無顯著性差異。美沙拉嗪與VSL＃3聯(lián)合治療組的表達(dá)量明顯低于單藥治療組。
　　 細(xì)胞分化相

20、關(guān)的信號因子:STAT3與P-STAT3以上兩項(xiàng)指標(biāo)的mRNA水平、蛋白質(zhì)水平及免疫組化IOD顯示:模型組表達(dá)量最高,NS組表達(dá)量次之,但兩者之間無顯著性差異。美沙拉嗪治療組較模型組表達(dá)量有明顯降低,VSL＃3組、熱滅活VSL＃3治療組STAT3、P-STAT3的表達(dá)量與美沙拉嗪組比較均無顯著性差異,美沙拉嗪與VSL＃3聯(lián)合治療組的表達(dá)量最低,顯著低于單藥治療組。
　　 13項(xiàng)隨機(jī)對照試驗(yàn)符合入選標(biāo)準(zhǔn),7項(xiàng)研究評價(jià)了緩解率,8項(xiàng)

21、研究評價(jià)了復(fù)發(fā)率,2項(xiàng)研究同時(shí)評價(jià)了緩解率和復(fù)發(fā)率。潰瘍性結(jié)腸炎總體緩解率RR為1.35,95％CI:[0.98,1.85];益生菌治療組與安慰劑組相比潰瘍性結(jié)腸炎緩解率RR為2.00(95％CI=1.35-2.96);療程為12個(gè)月以下組中,益生菌治療組與非益生菌治療組相比潰瘍性結(jié)腸炎緩解率RR為1.36(95％CI=1.07-1.73);潰瘍性結(jié)腸炎總體復(fù)發(fā)率RR為0.69,95％CI:[0.47-1.01];輕中度組益生菌治療與非

22、益生菌治療相比復(fù)發(fā)率RR為0.31(95％CI=0.14-0.61);益生菌治療組與安慰劑組相比復(fù)發(fā)率RR為0.25(95％CI=0.12-0.51);雙岐桿菌治療組與非益生菌治療組相比復(fù)發(fā)率RR為0.25(95％CI=0.12-0.51)。
　　 結(jié)論：三種造模方法均可成功誘導(dǎo)大鼠實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎模型,DSS造模方法死亡率低,安全系數(shù)高,與人類的UC病變類似,選擇DSS誘導(dǎo)的急性實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎動(dòng)物模型進(jìn)行下一步研究。
　　

23、益生菌合劑VSL＃3與熱滅活VSL＃3對急、慢性實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎有一定的療效,其治療作用與傳統(tǒng)治療藥物美沙拉嗪相當(dāng),三者之間無顯著性差異,益生菌VSL＃3與美沙拉嗪聯(lián)合治療急性實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎的療效最佳。益生菌合劑VSL＃3組、熱滅活VSL＃3組、美沙拉嗪組、VSL＃3與美沙拉嗪聯(lián)合治療組STAT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)的細(xì)胞因子(IL-23、IL-6、TGFβ)與細(xì)胞分化相關(guān)的信號因子(STAT3、P-STAT3)表達(dá)量明顯下降,與大鼠結(jié)腸炎緩解程度相符