TiM-3信號通路在小鼠實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎中的作用.pdf

1、背景與目的：
　　 炎癥性腸病(IBD)的病因和發(fā)病機(jī)制目前尚不清楚，但已明確Th免疫反應(yīng)和Toll樣受體(TLR)信號通路異常在其中起著重要作用，并且這些異常在不同類型的IBD(UC和CD)中有所不同，但它們具體的調(diào)控機(jī)制迄今仍不是很明確。Tim-3信號通路是新發(fā)現(xiàn)的調(diào)節(jié)Th免疫反應(yīng)的核心環(huán)節(jié)，并且與TLRs信號通路有密切關(guān)系。然而Tim-3信號通路在IBD發(fā)生發(fā)展中的作用，及它與IBD的Th免疫反應(yīng)和TLRs信號通路變化的關(guān)

2、系目前尚不清楚。為此，本研究在體內(nèi)不同類型小鼠實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎模型(分別類似人類的UC及CD的動物模型)中觀察了Tim-3信號通路、TLRs信號通路和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)的變化，并以它為干預(yù)靶點(diǎn)，觀察干預(yù)Tim-3信號通路對不同類型IBD的TLRs信號通路和Treg的影響，及其與疾病的的關(guān)系，從一新的角度探討IBD的發(fā)病機(jī)制，為IBD的防治提供新的靶點(diǎn)和方向。
　　 方法：
　　 1.實(shí)驗(yàn)分組：分為下以幾組：(1)Tim

3、-3抗體未處理小鼠，(2)Tim-3抗體預(yù)處理小鼠；每組內(nèi)再分別分為：①對照組，②DSS模型組，③TNBS模型組。
　　 2.IBD模型的建立：
　　 (1)DSS誘導(dǎo)小鼠炎癥性腸病模型的建立：6～8周齡的BALB/C小鼠自由飲用5％DSS溶液7天，建立小鼠急性結(jié)腸炎模型。對照組只飲用清潔飲用水。
　　 (2)TNBS誘導(dǎo)小鼠炎癥性腸病模型的建立：6～8周齡的BALB/C小鼠于禁食、不禁飲24小時后，乙醚麻醉，用

4、3.5F導(dǎo)管從肛門插入腸道深約5.5cm，灌注TNBS/50％乙醇溶液100μl，對照組灌注生理鹽水100μl，之后將小鼠倒置60秒。7天后處死小鼠。
　　 (3)小鼠Tim-3信號通路的干預(yù)：小鼠建模前12h腹腔內(nèi)注射100μg抗-Fc抗體消除非特異性吸附，再給予100μg抗-Tim-3mAb腹腔注射，對照小鼠給予同等劑量的IgG1。
　　 3.各項(xiàng)指標(biāo)的觀察和檢測：
　　 ①觀察各組小鼠每天體重、疾病活動指數(shù)

5、DAI的變化；
　　 ②肉眼觀察小鼠結(jié)腸大體形態(tài)的改變，HE染色觀察小鼠結(jié)腸病理組織學(xué)改變；
　　 ③Westernbolt方法檢測小鼠結(jié)腸組織中Tim-3、Tim-1、Foxp3、MyD88、TLR4、SIGIRR蛋白的表達(dá)；
　　 ④免疫組織化學(xué)染色檢測小鼠結(jié)腸組織中Foxp3、MyD88、SIGIRR和NF-kBp65的表達(dá)。
　　 結(jié)果：
　　 (1)小鼠體重及DAI積分變化
　　

6、 ①無論是在Tim-3抗體未處理組還是處理組，對照組小鼠體重呈持續(xù)上升狀態(tài)，模型組小鼠在造模后體重開始下降，在實(shí)驗(yàn)第5天各組體重均下降至最低點(diǎn)，隨后逐漸回升。在實(shí)驗(yàn)第5、7天各模型組小鼠體重下降百分比均明顯高于相應(yīng)對照組(P<0.01)，兩模型組之間比較無差異(P>0.05)。Tim-3抗體預(yù)處理的各模型組體重下降百分比均低于未處理組，在第7天的TNBS組有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，其他組間差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

7、　　 ②各組小鼠DAI積分在實(shí)驗(yàn)第5、7天都有顯著差異，無論是在Tim-3抗體未處理組還是處理組，各模型組顯著高于相應(yīng)對照組(P<0.01)，不同模型組之間比較無差異(P>0.05)；Tim-3抗體預(yù)處理的各模型組DAI積分均低于未處理組，在第7天的TNBS組有差異(P<0.05)，其他組間差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。
　　 (2)小鼠結(jié)腸病理學(xué)改變
　　 ①小鼠結(jié)腸黏膜大體形態(tài)：無論是在Tim-3抗體未處理組

8、還是處理組，對照組小鼠結(jié)腸黏膜未見充血、出血、水腫、糜爛、潰瘍，DSS及TNBS組可見結(jié)腸黏膜有較明顯充血、水腫、糜爛、潰瘍；Tim-3抗體預(yù)處理的各模型組結(jié)腸黏膜充血、水腫和糜爛較未處理組稍有減輕。
　　 ②HE染色觀察各組小鼠的腸道病理組織學(xué)變化，無論是在Tim-3抗體未處理組還是處理組，DSS及TNBS組小鼠的結(jié)腸炎癥程度、病變深度及隱窩破壞程度均高于相應(yīng)對照組(P<0.05)；不同模型組之間比較無差異(P>0.05)。T

9、im-3抗體預(yù)處理小鼠，無論是TNBS組還是DSS組，病理組織學(xué)損傷均顯著低于未處理小鼠(P<0.01)。
　　 (3)小鼠結(jié)腸黏膜Tim-3蛋白表達(dá)
　　 無論Tim-3抗體處理與否，各組間小鼠腸黏膜Tim-3蛋白的表達(dá)無差異(P>0.05)；Tim-3抗體預(yù)處理小鼠，各模型組Tim-3蛋白的表達(dá)高于未處理小鼠，但無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。
　　 (4)小鼠結(jié)腸黏膜Tim-1蛋白表達(dá)
　　 在Tim

10、-3抗體未處理組中，TNBS組高于對照組(P<0.05)，其它兩組間比較均無差異(P>0.05)；在Tim-3抗體預(yù)處理組中，三組間比較均無差異(P>0.05)；Tim-3抗體預(yù)處理各模型組Tim-1蛋白表達(dá)均低于未處理組，TNBS組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。
　　 (5)小鼠結(jié)腸黏膜Foxp3表達(dá)
　　 ①免疫印跡檢測發(fā)現(xiàn)，無論Tim-3抗體處理與否，F(xiàn)oxp3蛋白在三組間的表達(dá)無差異(P>0.05)；Tim

11、-3抗體預(yù)處理的各模型組Foxp3蛋白表達(dá)均高于未處理組，但無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。
　　 ②免疫組化染色發(fā)現(xiàn)，無論Tim-3抗體處理與否，各組間小鼠結(jié)腸黏膜中Foxp3陽性炎細(xì)胞數(shù)有差異，兩個模型組均低于相應(yīng)對照組(P<0.05)，且在Tim-3抗體處理組中TNBS組顯著高于DSS組(P<0.01)。同時Tim-3抗體預(yù)處理的各模型組Foxp3陽性細(xì)胞數(shù)均高于未處理小鼠，TNBS組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

12、r>　　 (6)小鼠結(jié)腸黏膜SIGIRR表達(dá)
　　 ①免疫印跡檢測發(fā)現(xiàn)，無論Tim-3抗體處理與否，SIGRR蛋白表達(dá)在三組間表達(dá)無差異(P>0.05)；Tim-3抗體預(yù)處理小鼠，各模型組SIGIRR蛋白表達(dá)均高于未處理小鼠，但都無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。
　　 ②免疫組化染色發(fā)現(xiàn)，Tim-3抗體未處理組中，小鼠結(jié)腸黏膜中SIGIRR表達(dá)有顯著差異，各模型組顯著低于對照組(P<0.01)；在Tim-3抗體預(yù)處理組，

13、各組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。同時Tim-3抗體預(yù)處理的各模型組SIGIRR表達(dá)均顯著高于未處理組(P<0.05)。
　　 (7)小鼠結(jié)腸黏膜MyD88表達(dá)
　　 ①免疫印跡檢測發(fā)現(xiàn)，在Tim-3抗體未處理組中，三組間MyD88蛋白的表達(dá)有差異，TNBS組顯著高于對照組和DSS組(P<0.01)，DSS組高于對照組，但無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；在Tim-3抗體預(yù)處理組中，兩個模型組都顯著高于對照組(P<0

14、.05)，模型組間比較無差異(P>0.05)；同時Tim-3抗體預(yù)處理組中的TNBS組MyD88表達(dá)低于未處理組(P<0.05)。
　　 ②免疫組化染色發(fā)現(xiàn)，無論Tim-3抗體處理與否，小鼠結(jié)腸黏膜炎細(xì)胞中MyD88表達(dá)有顯著差異，各模型高于對照組(P<0.05)，模型組間比較無差異(P>0.05)。同時Tim-3抗體預(yù)處理的各模型組MyD88的表達(dá)均低于未處理組(P<0.05)。
　　 (8)小鼠結(jié)腸黏膜TLR4表達(dá)<

15、br>　　 免疫印跡檢測發(fā)現(xiàn)，TLR4蛋白在Tim-3抗體未處理組中的表達(dá)有差別，TNBS組顯著高于DSS組及對照組(P<0.01)，DSS組高于對照組，但無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；在Tim-3抗體預(yù)處理組，TLR4蛋白在組間的表達(dá)有差異，DSS組高于TNBS組及對照組組(P<0.05)，TNBS組高于對照組，但無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。同時Tim-3抗體預(yù)處理組中DSS組TLR4的表達(dá)高于未處理組(P<0.05)。
　

16、　 (9)小鼠結(jié)腸黏膜、NF-kBp65表達(dá)
　　 免疫組化染色發(fā)現(xiàn)，無論Tim-3抗體處理與否，小鼠結(jié)腸黏膜中NF-kBp65的表達(dá)有顯著差異，各模型組顯著高于對照組(P<0.01)，各模型組間比較無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。Tim-3抗體預(yù)處理的各模型組NF-kBp65表達(dá)低于未處理組(P<0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 1.本研究成功的建立了DSS及TNBS誘導(dǎo)的小鼠實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎模型，Tim-3抗體預(yù)

17、處理后小鼠結(jié)腸炎癥減輕，提示了Tim-3抗體可以減弱小鼠實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎的炎癥反應(yīng)。
　　 2.Tim-3抗體預(yù)處理后小鼠實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎腸黏膜中Tim-3蛋白表達(dá)增加，而Tim-1蛋白表達(dá)降低，提示Tim-3及Tim-1可能參與了小鼠實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎的發(fā)病機(jī)制。
　　 3.Tim-3抗體預(yù)處理后小鼠實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎腸黏膜中Foxp3蛋白表達(dá)增加，提示了Tim-3抗體可能通過調(diào)控Treg細(xì)胞反應(yīng)來影響小鼠結(jié)腸炎的發(fā)生。
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