旱柳半胱氨酸蛋白酶基因克隆及鹽脅迫響應(yīng)功能分析.pdf

1、旱柳是一種耐鹽耐旱的植物。本文以旱柳為材料，采用生物信息學(xué)、RT-qPCR、基因克隆等技術(shù)，得到了旱柳SmCP基因cDNA及基因組全長(zhǎng)，分析其基因功能，得出結(jié)論如下：
　　1）從旱柳cDNA文庫(kù)中篩選出一個(gè)耐鹽相關(guān)的半胱氨酸蛋白酶基因，通過(guò)PCR克隆獲得旱柳SmCP基因cDNA全長(zhǎng)和基因組DNA全長(zhǎng)。生物信息學(xué)軟件分析得知該基因含有8個(gè)外顯子，7個(gè)內(nèi)含子，編碼359個(gè)氨基酸。同時(shí)該蛋白具有木瓜蛋白酶家族保守的結(jié)構(gòu)域：inhibit

2、or-I29和peptidase-C1A，與其他木瓜蛋白酶家族一樣，N末端有1個(gè)信號(hào)肽結(jié)構(gòu)，同時(shí)還有1個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)，屬于跨膜蛋白。
　　2）亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)顯示該基因位于液泡中；進(jìn)化樹(shù)分析表明該基因與毛果楊PtCP親緣關(guān)系最近。啟動(dòng)子元件預(yù)測(cè)顯示該基因啟動(dòng)子區(qū)包含熱脅迫、干旱脅迫、抗氧化響應(yīng)元件HSE、MBS、ARE，同時(shí)還含有茉莉酸甲酯、水楊酸、生長(zhǎng)素、赤霉素響應(yīng)元件MeJA、TCA-element、TGA-element、TATC

3、-box，表明SmCP極有可能參與了這些逆境脅迫的響應(yīng)。
　　3）分別提取不同鹽處理時(shí)間旱柳的根莖葉的RNA，利用RT-qPCR進(jìn)行旱柳SmCP組織特異性時(shí)空表達(dá)模式分析。結(jié)果顯示SmCP在旱柳根莖葉中都有表達(dá)，在葉中表達(dá)量最高，根和莖中表達(dá)量差異不大。在鹽脅迫的96小時(shí)的過(guò)程中，SmCP在根莖葉中動(dòng)態(tài)表達(dá)的。莖中表達(dá)趨勢(shì)不明顯，在葉中，脅迫24h的過(guò)程中，SmCP表達(dá)量逐漸升高，24h達(dá)到巔峰值，隨后下降。在根中，表達(dá)量在48h

4、時(shí)急劇升高，在96h表達(dá)量是0h的8倍左右。
　　4）構(gòu)建SmCP的原核表達(dá)載體pYES2.1-SmCP，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 Star（DE3），1M NaCl脅迫條件下進(jìn)行點(diǎn)板實(shí)驗(yàn)及繪制生長(zhǎng)曲線(xiàn)，結(jié)果顯示SmCP基因的轉(zhuǎn)化子生長(zhǎng)狀態(tài)都優(yōu)于空載，證明SmCP的導(dǎo)入提高了大腸桿菌耐鹽性。
　　5）構(gòu)建的植物表達(dá)載體pCAMBIA2300-SmCP轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌，侵染擬南芥，鑒定得到陽(yáng)性表達(dá)植株。隨后對(duì)轉(zhuǎn)基因植株及野生型擬南芥鹽脅