減重手術(shù)對肥胖糖尿病大鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)多樣性的影響.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、本文主要從以下幾方面進(jìn)行了論述:
  第一部分 自發(fā)性肥胖糖尿病大鼠的減重手術(shù)模型建立及其代謝效益分析
  目的:
  研究肥胖癥及其最常見慢性并發(fā)癥――2型糖尿病,建立肥胖動物模型是重要的前提條件。Zucker肥胖糖尿病(ZDF)大鼠是典型的肥胖糖尿病模型,該大鼠表現(xiàn)為顯著糖耐量異常、高胰島素血癥、外周胰島素抵抗和無酮癥表現(xiàn),與人的2型糖尿病發(fā)病機(jī)制極其類似,是很好的研究肥胖及其相關(guān)糖尿病的自發(fā)性疾病模型。對于肥胖合

2、并糖尿病患者,減重外科手術(shù)是被認(rèn)為是長期、有效的減重方法。其中,Roux-en-Y胃旁路術(shù)(RYGB)及袖狀胃切除術(shù)(SG)是目前較主流的兩種術(shù)式。本研究試圖在ZDF這一自發(fā)性肥胖糖尿`病大鼠上建立RYGB及SG兩種手術(shù)模型,并建立飲食匹配及空白對照組,觀察兩種術(shù)式對于該大鼠模型的體重及糖脂代謝等影響,為下一步實(shí)驗(yàn)作準(zhǔn)備。
  方法:
  選取8周雄性SPF級Zucker-Leprfa/CrlVr肥胖糖尿?。╖DF)大鼠40

3、只,隨機(jī)分為4組(n=10):(1)RYGB組(RYGB):行RYGB術(shù);(2)SG組(SG):行SG術(shù);(3)假手術(shù)-自由進(jìn)食組(AL):行假手術(shù),自由進(jìn)食基礎(chǔ)飼料,不限制飲水;(4)假手術(shù)-飲食匹配組(PF):給予與之配對的RYGB組1天前的攝食量。在RYGB手術(shù)中,切斷胃近端形成20%小胃,取空腸與空腸吻合口距屈氏韌帶10cm,距胃腸吻合口也是10cm;SG手術(shù)中,于胃前壁靠近大彎側(cè)距離幽門口約8mm作切口置入一次性輸液導(dǎo)管(直徑

4、4mm)作胃內(nèi)支持管建立殘胃容積平行小彎側(cè)離斷胃,使胃的體積減少70%-80%后形成袖管狀殘胃。術(shù)后3天正常進(jìn)食。本研究擬觀察項(xiàng)目:(1)手術(shù)建模情況;(2)大鼠體重、攝食量變化;(3)血糖、糖化血紅蛋白(HbA1c)、血清胰島素(INS);((4)口服葡萄糖耐量試驗(yàn)(OGTT)和胰島素耐量試驗(yàn)(ITT);(5)總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、總膽汁酸(TBA)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、血清游離脂肪

5、酸(FFA)等生化指標(biāo);(6)肝臟組織切片染色觀察。采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理,組內(nèi)比較采用t檢驗(yàn)。P<0.05為差異顯著,P>0.05無顯著差異。
  結(jié)果:
 ?。?)手術(shù)造模情況:RYGB組大鼠中6只存活,SG組7只存活,PF組及AL組大鼠全部存活。死亡原因主要分別為術(shù)后吻合口瘺及感染。
 ?。?)術(shù)后3周內(nèi)RYGB、PF組和SG組大鼠的體重均顯著低于AL組(P<0.05),至術(shù)后第4周起,RYGB

6、手術(shù)組大鼠的體重開始顯著低于PF組(P<0.05);從術(shù)后第7周起SG手術(shù)組大鼠的體重開始明顯增加,高于RY組(P<0.05),至第8周以后SG組體重甚至超過了AL組,但沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。
 ?。?)RYGB組大鼠在術(shù)后4周內(nèi)平均攝食量較實(shí)驗(yàn)前明顯下降,且低于AL組(P<0.05),4周后至實(shí)驗(yàn)結(jié)束時,RYGB組食量逐漸回升,但仍遠(yuǎn)低于對照組(P<0.05)。而SG組大鼠在術(shù)后5周內(nèi)平均攝食量與RYGB組大體一致,均

7、較實(shí)驗(yàn)前明顯下降,且低于AL組,其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),5周后SG組食量逐漸回升,并逐漸超過RYGB組,至第9周至術(shù)后10周實(shí)驗(yàn)結(jié)束時SG組攝食量達(dá)到與AL組大鼠相當(dāng)水平,但比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。
 ?。?)術(shù)后RYGB組、PF組及SG組大鼠糖耐量情況均較AL組明顯改善。至術(shù)后第10周時,RYGB組OGTT及ITT試驗(yàn)各個時間點(diǎn)的血糖值及AUC值、HbA1c等指標(biāo)均優(yōu)于PF組及AL組,比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異

8、(P<0.05),而SG組上述糖代謝指標(biāo)與RYGB組相當(dāng),比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。RYGB組術(shù)后第10周血清胰島素較其它組均明顯降低(P<0.05)。
 ?。?)RYGB與SG組手術(shù)后空腹TC和FFA含量與手術(shù)前比較均明顯下降,與PF組、AL組比較亦存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05),而TG含量與其他兩組比較無明顯下降(P>0.05)。同時對肝臟轉(zhuǎn)氨酶及病理切片的結(jié)果也發(fā)現(xiàn),兩種手術(shù)在改善ZDF大鼠非酒精性脂肪性肝臟炎癥的效

9、果也是顯著的。
  結(jié)論:
  我們成功在自發(fā)性ZDF大鼠建立了RYGB及SG兩種手術(shù)模型,并觀察到了在10周時間內(nèi),兩種手術(shù)對大鼠體重及糖脂代謝的影響。RYGB在減輕ZDF大鼠體重及改善血糖、減輕胰島素抵抗、脂質(zhì)紊亂及脂肪肝炎癥方面作用是明顯的,且不依賴于術(shù)后飲食變化。而SG對ZDF大鼠的糖脂代謝作用幾乎與RYGB手術(shù)相當(dāng),但在減輕體重及攝食量方面本次則未在該模型上體現(xiàn)。
  第二部分 減重手術(shù)對肥胖糖尿病大鼠的腸道

10、菌群結(jié)構(gòu)的影響
  目的:
  目前有關(guān)減重手術(shù)對肥胖及糖尿病緩解機(jī)制的研究主要集中在手術(shù)后熱卡攝入、體重減輕、胃腸道激素分泌的變化、胰島細(xì)胞增殖等方面。但以上機(jī)制都各有不足,且無法統(tǒng)一,目前仍沒有哪一種機(jī)制能完整清楚地解釋該術(shù)式的減重、降糖及后續(xù)的長期效應(yīng)。作為一種與宿主共存的環(huán)境因素,腸道菌群直接參與其各種代謝生理過程。最近許多研究報(bào)道揭示腸道菌群與肥胖、2型糖尿病的發(fā)生發(fā)展有著直接關(guān)系。減重代謝手術(shù),由于對胃腸道重建,

11、可能產(chǎn)生的各種解剖及生理上的變化都可能成為影響腸道菌群發(fā)生變化的潛在因素,我們將利用第一部分建立的ZDF大鼠的兩種減重手術(shù)(RYGB及SG)模型,研究術(shù)后腸道菌群的多樣性的變化,希望能夠找到與減重手術(shù)治療相關(guān)的一些細(xì)菌類群,揭示該手術(shù)對腸道菌群的調(diào)節(jié)作用。
  方法:
  實(shí)驗(yàn)動物的分組及手術(shù)模型建立同第一部分。于手術(shù)前及手術(shù)后10周處死大鼠前采集大鼠新鮮糞便樣本,各組隨機(jī)抽取6份樣本提取總DNA,純化并鑒定后,進(jìn)行16Sr

12、RNA基因V1-V3區(qū)PCR擴(kuò)增,繼而在在GSFLX+(Roche)平臺上進(jìn)行454測序。測序數(shù)據(jù)經(jīng)過統(tǒng)計(jì)、優(yōu)化及相關(guān)多變量統(tǒng)計(jì)分析,并用以代表腸道菌群的多樣性。
  結(jié)果:
 ?。?)經(jīng)過測序和優(yōu)化篩選,30個樣本總共得到供精準(zhǔn)分析的高質(zhì)量優(yōu)化序列309248條,平均讀長484bp。在97%相似性下,我們進(jìn)行OTU的劃分,得到22694個OTU。
 ?。?)多樣性分析發(fā)現(xiàn),從稀疏曲線的結(jié)果看,OTU數(shù)目增加的趨勢有逐

13、漸變緩趨勢,但仍然未達(dá)到飽和,提示ZDF大鼠腸道內(nèi)仍有少數(shù)未被鑒定的新物種。而Shannon曲線趨于平緩,說明本次測序量基本飽和,能夠代表ZDF大鼠腸道菌群的多樣性組成。各組樣本的文庫覆蓋率(Good’s coverage)均在85%以上,RYGB手術(shù)組反映多樣性的Shannon及Simpson指數(shù)與PF組、AL組及SG組三組比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的差別,具有更高的多樣性。
 ?。?)根據(jù)系統(tǒng)發(fā)育分析,30例樣本腸道內(nèi)菌群分類,分屬1

14、6個門,其中擬桿菌門(Bacteroidetes)在所有樣品腸道菌群中的比例為56.8%,是所測全部ZDF大鼠腸道菌群中常見的細(xì)菌類群,其次是厚壁菌門(Firmicutes),比例為41.5%,比例第三位的是變形菌門(Proteobacteria),占到約1.1%,其它幾門所占比例均不到1%。
 ?。?)各組進(jìn)行組間顯著性差異分析(metastats)發(fā)現(xiàn),RYGB組與AL組比,擬桿菌門(Bacteroidetes)/厚壁菌門(F

15、irmicutes)的比例明顯降低(P<0.05),與PF組則無差別(P>0.05);SG組與AL組比上述兩個主要門的變化不大(P>0.05)。
  (5)本研究還發(fā)現(xiàn)RYGB組中變形菌門(Proteobacteria)的豐度,特別是其中一主要分支Gammaproteobacteria綱的豐度增加,較其它各組均有明顯差別(P<0.05)。另一種菌即梭狀芽胞桿菌屬(Clostridium)在RYGB組術(shù)后的富集也較其它各組大鼠中有絕

16、對的優(yōu)勢,占這一屬總序列數(shù)的99%以上。
 ?。?)接下來主成分分析(PCA)和UniFrac方法對各組菌群在OTU(97%相似性)水平上差異分析發(fā)現(xiàn),RYGB組、PF組與SG組三組按不同手術(shù)方式分成三簇,但RYGB組與PF組有交叉,而SG組則較為集中;而AL組與PF組的離散趨勢也不如AL組與C組明顯。
  結(jié)論:
  各組ZDF大鼠糞便樣本16sRNA V1-V3區(qū)的454測序結(jié)果表明,各組均出現(xiàn)不同的菌群多樣性表現(xiàn)

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