農(nóng)桿菌介導(dǎo)AtNHX1基因轉(zhuǎn)化葡萄砧木99R的研究.pdf

1、本研究以葡萄砧木99R(Vitis berlandieriPlanchxV．rupestris Scheele’99R’)為材料，建立其分化頻率較高，培養(yǎng)方法簡(jiǎn)單的再生體系，為葡萄遺傳轉(zhuǎn)化研究打下基礎(chǔ)。采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法，將Na<'+>/H<'+>反向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白AtNHXl基因?qū)肫咸颜枘?9R中，以獲得耐鹽堿的砧木品種。本研究系統(tǒng)地探討了提高葡萄再生和遺傳轉(zhuǎn)化效率的影響因子，優(yōu)化了農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化葡萄的主要技術(shù)參數(shù)，建立起高效的遺傳轉(zhuǎn)化體

2、系。研究結(jié)果如下： 1.以葡萄砧木99R試管苗葉片、葉柄和莖段為外植體誘導(dǎo)不定芽再生。在MS培養(yǎng)基中附加不同濃度的6-BA與IBA、TDZ與IBA、6-BA與2,4-D組合。結(jié)果表明，葉片和葉柄適宜的再生培養(yǎng)基為MS+BA5.0mg·L<'-1>+IBAO·1mg·L<'-1>，再生率分別為40.54％和50.00％，莖段為MS+BA2.0mg-L<'-1>_+IBA0.02mg·L<'-1>，再生率達(dá)62.50％。TDZ與IBA組合對(duì)

3、葡萄砧木99R不定芽的誘導(dǎo)效果較差，再生率最高的也只有7.69％。6-BA-2,4-D組合以MS+BA8mg·L<'-1>+2,4-D0.05mg·L<'-1>_下再生率最高，葉柄達(dá)42.11％。一定時(shí)間的暗培養(yǎng)處理利于葡萄砧木99R不定芽的再生，3周為最適宜的暗培養(yǎng)時(shí)間。不同節(jié)位外植體不定芽再生率隨葉片節(jié)位的下降而降低。2．以葡萄砧木99R的葉片、葉柄及莖段為農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化受體，通過(guò)對(duì)GUS基因的瞬時(shí)表達(dá)率的分析，研究此轉(zhuǎn)化體系的最佳

4、實(shí)驗(yàn)參數(shù)。實(shí)驗(yàn)表明，侵染4分鐘、共培養(yǎng)2天、Km3.0mg·L<'-1>，添加AS75mg·L<'-1>和Cef250mg·L<'-1>時(shí)，GUS的瞬時(shí)表達(dá)率最高。在MS+BA5.0mg·L<'-1>+IBA0.1mg·L<'-1>+Cef250mg·L<'-1>+Km3.0mg·L<'-1>培養(yǎng)基上繼代篩選獲得抗性芽。3．用優(yōu)化的農(nóng)桿菌介導(dǎo)法對(duì)葡萄砧木99R的2546個(gè)外植體轉(zhuǎn)化AtNHXl基因，獲得25株抗性苗，轉(zhuǎn)化率為0.98％，