內(nèi)毒素致傷新生大鼠腸組織ICAM-1、氧化應(yīng)激及金屬硫蛋白的變化.pdf

1、壞死性小腸結(jié)腸炎(Necrotizingenterocolitis，NEC)是新生兒期最嚴(yán)重的胃腸道疾病。文獻(xiàn)首次報(bào)道新生兒NEC是在二十世紀(jì)60年代中期，盡管由于肺表面活性物質(zhì)的應(yīng)用及醫(yī)務(wù)人員綜合素質(zhì)的提高，許多小早產(chǎn)兒得以存活，但NEC發(fā)病率并未下降，并認(rèn)為NEC將取代肺疾病而成為早產(chǎn)兒死亡的主要原因。在美國(guó)，每1000例活產(chǎn)嬰兒中就有1～3例發(fā)生NEC，每年有2000～4000例新生兒患該病，其中27％～63％需外科手術(shù)治療。根據(jù)

2、流行并學(xué)調(diào)查，國(guó)外占極低出生體重兒的10％～26％，國(guó)內(nèi)亦呈逐年上升趨勢(shì)；其病死率高達(dá)10％～30％。而且，根據(jù)Bell's分級(jí)，NEC嚴(yán)重程度與出生體重及胎齡呈負(fù)相關(guān)，甚至有報(bào)道出生體重低于1000g，胎齡小于28w的超低出生體重兒其病死率高達(dá)100％。 引起NEC的病因很多，主要包括早產(chǎn)、腸道配方乳喂養(yǎng)、感染及腸缺氧/缺血。多種病因與新生兒不成熟的腸粘膜屏障協(xié)同作用導(dǎo)致粘膜屏障功能破壞，觸發(fā)炎癥連鎖反應(yīng)，引起NEC。其特征性

3、病理改變?yōu)槟绦曰蛉毖阅c壞死。 盡管經(jīng)過(guò)40多年研究，其發(fā)病機(jī)制仍不清楚，仍是新生兒死亡的主要原因之一。存活者常發(fā)生腸狹窄、短腸綜合癥等。過(guò)去，認(rèn)為NEC的存活者到兒童期有正常的神經(jīng)認(rèn)知發(fā)育，但最近提出，其腦發(fā)育遲緩的發(fā)生率增加。而且，據(jù)調(diào)查數(shù)據(jù)顯示，NEC是監(jiān)測(cè)極低出生體重兒神經(jīng)發(fā)育預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。因而了解NEC病因及發(fā)病機(jī)制，對(duì)于尋找其有效的治療和預(yù)防措施具有重要意義。目前國(guó)外研究人員推測(cè)NEC可能的發(fā)病機(jī)制有：始發(fā)環(huán)

4、節(jié)可能是血小板活化因子(PAF)與脂多糖(LPS)和/或TNFα協(xié)調(diào)作用觸發(fā)炎癥連鎖反應(yīng)，多型核白細(xì)胞激活后與血管內(nèi)皮細(xì)粘附，血管通透性增加，補(bǔ)體激活、NF-κB活化，誘導(dǎo)促炎細(xì)胞因子、粘附分子、炎癥介質(zhì)和ROS釋放，最后血管收縮，導(dǎo)致缺血/再灌注。來(lái)自黃嘌呤氧化酶系統(tǒng)的大量活性氧(ROS)導(dǎo)致氧化應(yīng)激損傷是腸損傷的最終途徑。能否發(fā)生NEC或NEC的嚴(yán)重程度取決于損傷機(jī)制和防御機(jī)制(主要為nNOS)之間的平衡。若前者占優(yōu)勢(shì)將導(dǎo)致粘膜屏障

5、功能?chē)?yán)重受損，腸損傷，細(xì)菌入侵，最終形成惡性循環(huán)，導(dǎo)致休克、敗血癥，甚至死亡。目前有關(guān)NEC的研究很多，國(guó)外學(xué)者為研究NEC建立許多動(dòng)物模型，大致分為三種： 1.血小板活化因子(PAF)、脂多糖和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)誘發(fā)腸壞死 2.缺氧+LPS/缺氧引發(fā)NEC 3.缺氧、腸喂養(yǎng)和PAF誘導(dǎo)新生動(dòng)物NEC 上述模型從不同角度闡述了新生兒NEC的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程，但均不能完美解釋人類NEC。NEC時(shí)腸

6、粘膜屏障功能失調(diào)，活性氧是其腸損傷的最終途徑，氧化與抗氧化失衡是NEC重要的發(fā)病機(jī)制之一。 中性白細(xì)胞(PMN)激活后與腸粘膜內(nèi)皮細(xì)胞粘附，促發(fā)炎癥連鎖反應(yīng)，是其發(fā)病的始發(fā)環(huán)節(jié)。細(xì)胞間粘附分子-1(ICAM-1)在該過(guò)程中發(fā)揮重要作用。ICAM-1表達(dá)于內(nèi)皮細(xì)胞，介導(dǎo)白細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的牢固黏附。在人類許多炎癥過(guò)程及動(dòng)物腸缺血/再灌注、腸移植和敗血癥模型中，其表達(dá)對(duì)PMN的聚集具有重要作用。已有研究表明LPS可誘導(dǎo)腸組織ICAM-

7、1的表達(dá)。Sun等人發(fā)現(xiàn)P-選擇素缺陷小鼠和細(xì)胞間粘附分子-1(ICAM-1)缺陷小鼠(經(jīng)巖藻素-選擇素抑制治療后)可抵御PAF造成的損害，表明粘附分子在腸損傷中的重要作用。有關(guān)ICAM-1在新生鼠腸損傷中的表達(dá)如何，及其在NEC發(fā)生中的動(dòng)態(tài)變化，目前尚不清楚。 來(lái)自黃嘌呤氧化酶系統(tǒng)的大量活性氧(ROS)導(dǎo)致氧化應(yīng)激損傷是腸損傷的最終途徑。NEC歸類于所謂的“新生兒自由基疾病”。在NEC患兒及NEC實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型均發(fā)現(xiàn)存在高水平的

8、促炎細(xì)胞因子、一氧化氮(NO)和ROS。 谷胱甘肽(glutathione，GSH)是體內(nèi)重要的抗氧化物。維持細(xì)胞內(nèi)氧化-還原平衡。參與細(xì)胞信號(hào)調(diào)節(jié)和基因轉(zhuǎn)錄。直接與ROS作用，并能與NO反應(yīng)，限制過(guò)氧亞硝酸ROS的產(chǎn)生，發(fā)揮解毒功能。GSH氧化/還原比率是評(píng)價(jià)氧化應(yīng)激的重要指標(biāo)。有研究認(rèn)為腸缺血/再灌注損傷時(shí)，GSH含量降低。全身炎癥反應(yīng)和敗血癥時(shí)GSH合成必需的氨基酸，可增加血GSH濃度，改善預(yù)后。GSH在NEC中變化尚存在

9、爭(zhēng)議：Haase在新生豬缺氧/復(fù)氧的NEC模型中發(fā)現(xiàn)GSH降低；Hall等在NEC患兒血中并未發(fā)現(xiàn)總GSH有所下降。 金屬硫蛋白(metallothionein，MT)是一種低分子量、富含半胱氨酸的重金屬結(jié)合蛋白，具有抗氧化作用，是一種有效的自由基清除劑。作為一種新型抗氧化劑，其在新生鼠腸損傷中的作用尚不清楚。Takano等研究證明內(nèi)源性MT在乙醇誘發(fā)的胃十二指腸損傷中具有細(xì)胞保護(hù)作用。另有研究發(fā)現(xiàn)給予鋅制劑誘導(dǎo)MT合成，但對(duì)實(shí)

10、驗(yàn)性結(jié)腸炎無(wú)影響。Oz等研究認(rèn)為MT過(guò)度表達(dá)對(duì)炎癥性腸病的發(fā)生、發(fā)展無(wú)影響。國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)動(dòng)態(tài)研究金屬硫蛋白(MT)在新生鼠腸損傷中的作用。 本研究以LPS致新生大鼠腸損傷為對(duì)象，應(yīng)用形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)等檢測(cè)方法，動(dòng)態(tài)觀察小腸形態(tài)的演變過(guò)程；研究谷胱甘肽抗氧化系統(tǒng)的變化；探討ICAM-1在新生鼠腸損傷中的表達(dá)和調(diào)控機(jī)制；研究金屬硫蛋白在新生鼠腸損傷中的動(dòng)態(tài)變化及作用機(jī)制。旨在闡明新生兒NEC是腸粘膜屏障損傷機(jī)制與內(nèi)源性防御機(jī)制失衡

11、的結(jié)果，為完善新生兒NEC的發(fā)病機(jī)制及尋求有效的防治措施奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 材料與方法一、動(dòng)物模型健康24小時(shí)內(nèi)新生Wistar大鼠，隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組腹腔注射5mg/kgEcoliO55：B5內(nèi)毒素，對(duì)照組注射等量生理鹽水。注射后各組均放回母鼠旁，繼續(xù)哺乳，直至實(shí)驗(yàn)結(jié)束。 二、實(shí)驗(yàn)標(biāo)本采集及處理實(shí)驗(yàn)組分別于LPS注射后1h、3h、6h、12h和24h隨機(jī)處死后分離胃腸道。用于回腸形態(tài)學(xué)觀察、免疫組織化學(xué)檢測(cè)的標(biāo)本置于4.0％多

12、聚甲醛中固定；其余標(biāo)本置于DEPC浸泡的Eppendorf管中，于-80℃超低溫冰箱中保存。 三、實(shí)驗(yàn)方法及檢測(cè)指標(biāo)1.回腸形態(tài)學(xué)研究(1)大體觀察：各組于相應(yīng)的時(shí)間點(diǎn)處死后，打開(kāi)腹腔，觀察腸大體改變。 (2)光鏡下觀察：固定后的回腸組織常規(guī)脫水，石蠟包埋，切片5μm，HE染色，觀察其病理改變，進(jìn)行腸損傷評(píng)分。 2.回腸組織蛋白及基因水平研究(1)谷胱甘肽(GSH)，氧化型谷胱甘肽(GSSG)，谷胱甘肽過(guò)氧化物酶

13、(GSH-Px)，髓過(guò)氧化物酶(MPO)，丙二醛(MDA)，二氨氧化酶(DAO)及腸組織蛋白含量的測(cè)定采用化學(xué)方法。 (2)免疫組織化學(xué)方法用于回腸組織細(xì)胞間粘附分子-1(ICAM-1)和金屬硫蛋白(MT)的定位和蛋白表達(dá)檢測(cè)。 (3)RT-PCR法檢測(cè)回腸組織ICAM-1、MT1、MT2mRNA的表達(dá)。 四、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(-X±S)表示，經(jīng)SPSS13.0forwindows數(shù)據(jù)分析軟件處理

14、。組間比較進(jìn)行t檢驗(yàn)，相關(guān)分析采用Spearman分析。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯著性以P＜0.05表示。 結(jié)論：1.LPS誘導(dǎo)的新生鼠腸損傷模型在臨床特點(diǎn)和病理變化上符合新生兒NEC的發(fā)生、發(fā)展特征。 2.GSH抗氧化系統(tǒng)抗氧化能力的降低，引起氧化-抗氧化失衡在新生鼠腸損傷中起重要作用，可能是NEC發(fā)生的重要機(jī)制之一。 3.LPS作用于新生大鼠后，通過(guò)上調(diào)ICAM-1蛋白和基因表達(dá)，使PMN牢固粘附于腸上皮細(xì)胞，進(jìn)而通過(guò)增加活