短暫氧化應(yīng)激對大鼠內(nèi)耳的損害及保護.pdf

1、本文為進一步探討葡萄籽提取物(低聚原花青素)在內(nèi)耳抗氧化損傷中的作用機理，選取了耳蝸血管紋作為研究靶點，采用半定量的逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)技術(shù)觀察短暫的氧化應(yīng)激和抗氧化劑的保護對血管紋特異性Isk表達的影響，觀察血管紋在耳蝸氧化和抗氧化中所到的作用。為氧化損傷及抗氧化劑在內(nèi)耳的深入研究提供了實驗依據(jù)。 研究方法： 一、耳蝸血管紋和Cort i器的取材及離體培養(yǎng)。取新生7天的wistar大鼠，消毒后用頸脫法處死

2、，后斷頭；矢狀位平均分成兩半，去除腦組織，暴露耳蝸底部骨質(zhì)，在解剖顯微鏡下將聽泡完整取出，置于所配制的生理溶液中，去除骨壁暴露螺旋韌帶，將襯于螺旋韌帶內(nèi)側(cè)壁的血管紋與螺旋韌帶剝離，取出完整的血管紋，血管紋特有的毛細血管分布可與耳蝸內(nèi)的其他相似結(jié)構(gòu)相區(qū)別，然后將去除螺旋韌帶的耳蝸中的Corti器沿蝸軸逆時針完整取下，從動物處死到Corti器和血管紋完整取出，共需5分鐘，因而不影響所取Corti器和血管紋的生物活性，放入培養(yǎng)液中培養(yǎng)，培養(yǎng)在

3、37℃，5％CO<,2>孵育箱中。 二、COrt i器和血管紋細胞輪廓的觀察。將實驗組和對照組的血管紋和Corti器固定，用TRITC-Philloidin避光染色，放在正置熒光顯微鏡下觀察并拍照。。 三、血管紋細胞核的觀察將實驗組和對照組的血管紋用PI避光染色，在倒置熒光顯微鏡下觀察是否組織中有細胞核出現(xiàn)，并觀察細胞核形態(tài)的改變。如果可見PI染色的細胞核，再用TIJNEL試劑盒鑒定受損細胞是否為凋亡細胞。操作步驟按照該

4、試劑盒所述步驟進行。 四、血管紋內(nèi)ROS的動態(tài)測量在實驗組和對照組培養(yǎng)0、10、30、60分鐘時將DHP123放入培養(yǎng)液中(終濃度為20uM)在激光共聚焦顯微鏡下，(激發(fā)波長568nm，發(fā)射波長615nm，)ROS產(chǎn)生且濃度發(fā)生變化時，熒光強度也發(fā)生變化，用Adobe Photoshop 7.0 Software做定量分析繪制ROS產(chǎn)量的時間分布圖。 五、Gorti器和血管紋細胞線粒體膜電位的測量在實驗組和對照組繼續(xù)培養(yǎng)

5、30分鐘、2小時、8小時后在培養(yǎng)液中加入JC-1染色10分鐘后，PBS洗3次，在倒置熒光顯微鏡下觀察并拍照。 六、ABR反應(yīng)閾的測定用藥前及用藥后6個月各測一次。在隔音的電屏蔽室內(nèi)常規(guī)方法測試ABR，記錄反應(yīng)閾。用Danac-7型聲刺激器行短聲刺激，頻率20次/s，掃描時間10ms，濾波100-300Hz，聲輸出范圍0-100dB，信號疊加128次，以Ⅲ波反應(yīng)閾為標準判定聽閾。 七、血清及耳蝸SOD檢測用藥6個月后，取每

6、只動物血1ml和左耳蝸，測量血清和耳蝸內(nèi)的SOD。 八、RT-PCR檢測血管紋邊緣細胞Isk mRNA表達的變化提取血管紋的總RNA：每個實驗組和對照組取分別取10個血管紋，按Trizol試劑盒操作說明提取細胞總RNA；測定總RNA濃度、純度和完整性；逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA；多聚酶鏈反應(yīng)(PCR)。 研究結(jié)果： 一、短暫氧化應(yīng)激后離體大鼠血管紋和Cotti器細胞的損傷。 1、短暫氧化應(yīng)激后血管紋細胞的損傷：用

7、TRITC-Philloidin染色觀察實驗組血管紋細胞在培養(yǎng)后的2小時和8小時后分別出現(xiàn)細胞的濃縮和溶解：用PI處理對照組和實驗組的血管紋，對照組在正常培養(yǎng)8小時后PI染色陰性，說明無細胞核損傷，4％多聚甲醛固定后，PI染色見細胞核分布規(guī)整，無核形態(tài)改變；對實驗組培養(yǎng)后2小時、8小時的血管紋用PI染色，觀察到與PI結(jié)合的細胞核，且有細胞核形態(tài)的改變；為進一步確定細胞損傷或死亡形式，用TUNEL試劑盒處理對照組正常培養(yǎng)8小時的血管紋和實

8、驗組培養(yǎng)8小時后的血管紋，觀察到部分細胞的凋亡。 2、短暫氧化應(yīng)激后Corti器毛細胞的損傷：用TRITC-Philloidin處理對照組和實驗組的Corti器，正常培養(yǎng)8小時后對照組Corti器的毛細胞排列整齊無缺失；實驗組在繼續(xù)培養(yǎng)8小時后Corti器毛細胞出現(xiàn)缺失。 二、短暫氧化應(yīng)激后離體大鼠血管紋和Corti器細胞線粒體膜電位的改變。 1、短暫氧化應(yīng)激后耳蝸血管紋線粒體膜電位的改變：用JC-1染液處理對照

9、組和實驗組的血管紋，觀察血管紋內(nèi)線粒體膜電位的改變，JC-1染液，在線粒體內(nèi)呈電位依賴式聚集，所以用來探測線粒體膜電位的改變，JC-1聚集在線粒體膜電位較高處，呈紅色或橘紅色。顏色消失即線粒體膜電位消失。對照組在培養(yǎng)8小時后仍無線粒體膜電位的消失；實驗組血管紋細胞內(nèi)的線粒體膜電位在去除氧化應(yīng)激后的30分鐘、2小時、8小時后逐漸消失。 2、短暫氧化應(yīng)激后Corti器細胞線粒體膜電位的改變：用JC-1處理對照組和實驗組的Corti器

10、，對照組的線粒體膜電位在正常培養(yǎng)8小時后的Corti器中存在，且主要集中分布在蓋膜區(qū)和毛細胞區(qū)；實驗組的細胞線粒體膜電位在培養(yǎng)2小時后的Corti器中完全消失。 三、短暫氧化應(yīng)激后血管紋內(nèi)ROS的動態(tài)測量。在實驗組和對照組培養(yǎng)0、10、30、60、120分鐘時將DHR123放入培養(yǎng)液中(終濃度為20uM)在激光共聚焦顯微鏡下，(激發(fā)波長568nm，發(fā)射波長615nm，)觀察熒光強度隨時間的變化：對照組血管紋中幾無ROS；短暫的氧

11、化應(yīng)激后的實驗組中血管紋內(nèi)開始產(chǎn)生ROS： 0時刻無ROS產(chǎn)生，10分鐘時熒光微弱；30分鐘后熒光略有增強；60分鐘時熒光明顯增強接近所觀察到的最高強度；120分鐘時與60分鐘時強度接近。 四、在體實驗中ABR閾值及SOD的測量。 1、ABR閾值：用藥前，兩組ABR反應(yīng)閾比較，差異無顯著性意義P>0.05；用藥后，兩組ABR反應(yīng)閾比較，差異顯著P<0.01；OPt防治組反應(yīng)閾較自然衰老對照組低。 2、血清及耳蝸S

12、OD含量：OPC防治組與自然衰老對照組血清及耳蝸SOD含量相比較，均有顯著性差異P<0.01；OPC防治組血清及耳蝸SOD活性增強。 3、耳蝸基底膜外毛細胞的缺失：OPC組和自然衰老對照組耳蝸中間部位均無明顯的毛細胞缺失，頂回接近頂端的外毛細胞均有缺失，但兩組間無顯著性差異P>0.05；對照組底回外毛細胞缺失約為14％，OPC防治組底回相同部位外毛細胞缺失率約為7％，二者有顯著性差異P<0.01。 五、RT-PCR檢測離

13、體血管紋細胞Isk mRNA的表達血管紋細胞可見到IskmRNA于368bp處出現(xiàn)特異性擴增帶，正常培養(yǎng)組IskmRNA于368bp出現(xiàn)明顯的強擴增帶，H<,2>O<,2>作用后出現(xiàn)明顯減弱的特異性擴增帶，H<,2>O<,2>+OPC特異性擴增帶較H<,2>O<,2>作用后明顯增強。 研究結(jié)論： 1、短暫的氧化刺激可以激發(fā)耳蝸內(nèi)源性ROS的產(chǎn)生，使線粒體膜的完整性遭到破壞，從而導(dǎo)致耳蝸Corti器和血管紋的損傷和死亡。