三種藥用植物揚子毛茛、石龍芮和臭靈丹的抗病毒研究.pdf

1、病毒是一類嚴重危害人類健康的病原體。研究表明,有60％的疾病是由病毒感染引起的,而病毒感染性疾病已成為我國人口死亡的主要原因之一。新型病毒的不斷出現,如人類免疫缺陷病毒,非典型性肺炎病毒等,則對抗病毒藥物的開發(fā)提出更高的要求。病毒是一類細胞內病原體,其基本結構是核酸和蛋白質外殼,必須利用活細胞宿主的各種生物化學機制進行復制。病毒的結構、酶和復制機制均是抗病毒藥物的作用靶點。但目前臨床所用的抗病毒藥物存在著毒副作用大、作用不徹底等缺陷,因

2、此,開發(fā)新型抗病毒藥物一直藥物研究的熱點之一。從植物中發(fā)現天然抗病毒藥物,是開發(fā)抗病毒藥物的重要途徑。特別是我國的傳統(tǒng)中醫(yī)藥和民族民間藥物,蘊藏著豐富的寶藏,在發(fā)掘新型抗病毒有效物質和天然藥物方面有著十分廣闊的前景。
　　本研究分兩部分,分別研究了揚子毛茛和石龍芮抗乙型肝炎病毒,以及臭靈丹抗流感病毒和單純皰疹病毒的作用,從中發(fā)現了一些具有低毒高效的抗病毒化合物,為新型抗病毒藥物的研究奠定了基礎。第一部分、揚子毛茛和石龍芮抗乙型肝炎

3、病毒研究乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)感染嚴重威脅著我國人民的生命健康和社會經濟發(fā)展。目前我國總人口的10%感染或既往感染過HBV,而慢性HBV感染人數占全世界慢性HBV感染人數的一半以上。目前臨床一線的抗HBV藥物有拉米夫定,干擾素等,這些藥物均存在毒副作用及耐藥性等問題,所以開發(fā)新型的抗HBV藥物已成為當今國內外新藥研究的熱點。毛茛屬植物在我國資源豐富,產量大,一般具有小毒,有利濕退黃、溫寒止痛、散寒通滯

4、等功效,主要用于治療肝炎、黃疸、瘧疾、偏頭痛、胃痛、扁桃體炎等?，F代藥理研究表明,毛茛屬植物具有抗腫瘤、抗菌、抗病毒等活性。我們在分離純化兩種毛茛屬植物-揚子毛茛和石龍芮的化合物的基礎上，以
　　HepG2.2.15細胞為模型，測定從揚子毛茛和石龍芮提取的共19種化合物的抗HBV活性。
　　樣品由本研究組植化室提供，分別為芹菜素．4'-O-a-L-鼠李糖苷、芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖-4'-O-a-L-鼠李糖苷、芹菜素-

5、8-C-a-L-阿拉伯糖苷、芹菜素-8-c-β-D-半乳糖苷、小麥黃素-7-O-β-D-葡萄糖苷、小麥黃素、木犀草素、東莨菪內酯、馬栗樹皮素、濱蒿內酯、阿魏酸、原兒茶酸、小毛茛內酯、豆甾-4-烯-3,6-二酮、豆甾醇、二十烷酸、β-谷甾醇、6-羥基-甲氧基香豆素以及原兒茶醛。
　　藥物對細胞的毒性試驗：胰酶消化細胞，以1*105個/mL濃度接種96孔板，每孔0.2 mL，37℃，5% CO2培養(yǎng)24h，待細胞貼壁后，換用10倍系列

6、稀釋的含藥培養(yǎng)液，每個樣品配制4種濃度，每濃度各3個復孔，同時設陰性對照。每4天換含樣品的培養(yǎng)基，第12天以MTT法測定樣品對細胞的毒性作用。
　　藥物對HBV復制的抑制實驗：以lX105個/mL濃度接種96孔板，每孔0.2 mL，37℃，5%CO2培養(yǎng)24 h，根據藥物毒性實驗結果，選用IC10為最大實驗濃度，共設3個劑量組，每濃度各3復孔，同時設立空白細胞對照。每4天換含樣品的培養(yǎng)基，第12天收獲培養(yǎng)上清，同時測定乙型肝炎表面

7、抗原(Hepatitis surface antigen，HBsAg)，乙型肝炎e抗原(Hepatitis e antigen，HBeAg)及HBV-DNA。
　　實驗結果表明，6-羥基-7-甲氧基香豆素對HepG2.2.15細胞分泌HBsAg，HBeAg有不同程度的抑制作用，而在實驗濃度下，拉米夫定則無明顯的抑制作用。
　　我們用定量PCR法測定了藥物作用后HepG2.2.15細胞培養(yǎng)上清中HBVDNA濃度，結果顯示：芹菜

8、素-4- O-a-L-鼠李糖苷、芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖-4-O-a-L-鼠李糖苷、小麥黃素-7-O-β-D-葡萄糖苷和小麥黃素對HepG2.2.15細胞HBV-DNA的復制有不同程度的抑制作用，且隨樣品濃度增大其抑制作用增強。為了確證定量PCR試驗的準確性，我們還用斑點雜交法測定有上述活性樣品處理的HepG2.2.15細胞培養(yǎng)上清中HBV-DNA，試驗結果證實了上述4個樣品對HBV-DNA復制的抑制作用。
　　由于目前臨床

9、使用的一些抗病毒藥物對肝臟等重要器官有一定的毒副作用，而研究表明這是由于這些藥物對線粒體功能的抑制所致。因此，我們采用了多重PCR法測定樣品處理后HepG2.2.15細胞中線粒體高變區(qū)DNA和持家基因β-actin之間的比例，以此確定樣品對線粒體是否有抑制作用。實驗表明，上述4個樣品對HepG2.2.15細胞線粒體基因復制并無抑制作用，結果證實這些樣品的安全性。
　　綜上所述，我們測定了從揚子毛茛和石龍芮中分離出的19種化合物的抗

10、HBV活性，結果表明芹菜素-4-O-a-L-鼠李糖苷、芹菜素-7-D-β-D-葡萄糖-4-O-a-L-鼠李糖苷、小麥黃素-7-o-β-D-葡萄糖苷和小麥黃素等4個化合物對HepG2.2.15細胞HBV-DNA的復制有著抑制作用，而6-羥基-7-甲氧基香豆素對HepG2.2.15細胞HBsAg，HBeAg的表達有一定的抑制作用。我們同時以臨床使用的拉米夫定作為陽性對照藥，實驗表明，其對HepG2.2.15細胞HBV-DNA地復制有很強的抑

11、制作用，但對HBsAg，HBeAg表達基本無影響。
　　芹菜素-4-O-a-L-鼠李糖苷、芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖-4-O-a-L-鼠李糖苷、小麥黃素-7-O-β-D-葡萄糖苷和小麥黃素等4個化合物均屬黃酮苷類化合物，而黃酮苷類化合物有著明顯的抗菌、抗病毒和保護心臟等作用。這些化合物抗HBV的作用機理還尚待研究，但從其對HBV作用效果和拉米夫定相比較，其都對HBV-DNA的復制有抑制作用，而對HBsAg，HBeAg表達基本無

12、影響，因此我們推測其抗HBV的機理有可能在于對DNA聚合酶的抑制作用。
　　總之，揚子毛茛顯示出較強的抑制乙型肝炎病毒復制的活性，有待于進一步深入研究并開發(fā)成治療乙型肝炎的藥物制劑。本研究首次證實了毛茛屬植物悠久的治療肝炎的藥用歷史的科學依據，揭示了揚子毛莨抑制乙型肝炎病毒復制的物質基礎。
　　第二部分、臭靈丹抗病毒研究
　　臭靈丹(Laggera pterodonta DC.Benth)為云南民間的常用中草藥，本品首

13、載于《滇南本草》“其味苦、辛、性寒，有毒。陰中之剛也，治風熱積毒，臟腑不和。通行十二經絡，發(fā)散瘡癰”。具有清熱解毒、消腫拔膿之功效。據現代研究資料表明，臭靈丹的主要化學成分為黃酮類化合物、倍半萜類化合物等，其具有祛痰和抗腫瘤的作用，用于流行性感冒、呼吸道感染、扁桃體炎、腮腺炎、口腔炎、咽喉炎、支氣管炎、瘧疾等疾病的治療。
　　本研究所用臭靈丹全草采自云南省騰沖縣，由中國科學院昆明植物研究所彭華教授鑒定為臭靈丹(Laggera pt

14、erodonta DC.Benth)，藥材存放中國科學院昆明植物研究所西南植物化學及植物資源國家重點實驗室(No.200308LP)。
　　用熱水醇提法制備臭靈丹提取物，用三氯化鐵．鐵氰化鉀顯色法測定提取物中總酚含量，并用HPLC法測定提取物中異綠原酸含量。結果顯示，臭靈丹提取物中主要成分為酚類物質，總酚占提取物的53.0%，而異綠原酸占臭靈丹提取物的38%，為酚類化合物中的主要成分。
　　細胞長成單層的96孔板，棄去培養(yǎng)液

15、，加入100 TCIDso病毒液，37℃、5% C02下吸附2h，棄去病毒液，加入2倍連續(xù)稀釋的被試樣品，每濃度3孔，37℃、5% C02下培養(yǎng)3天，顯微鏡下觀察細胞病變，記錄病變程度（Cytopathic effect，CPE），計算樣品對病毒的抑制率及半數抑制濃度(IC50)。結果表明，臭靈丹提取物及異綠原酸體外對l型單純皰疹病毒和、2型單純皰疹病毒和甲型人流感病毒均有較強的抑制作用，異綠原酸應為臭靈丹提取物中抗病毒的主要活性成分。

16、
　　用雞胚法測定臭炅丹提取物對流感病毒的抑制作用，將不同稀釋度的藥液分別注射0.25 mL于雞胚中，半小時后經相同途徑注射100 EIDso半數感染量的病毒0.1 mL，孵育5天。收集尿囊液，測其血凝效價滴度。結果表明，臭靈丹提取物濃度為10mg/胚劑量組對流感病毒有明顯的抑制作用。
　　以滴鼻法感染小鼠致小鼠流感病毒感染模型，并以此測定臭靈丹提取物對流感病毒致小鼠出血性肺炎的肺指數和肺指數抑制作用，以及對流感病毒致小鼠病