高沉默效率植物病毒雙鏈RNA的抗病毒研究.pdf

1、RNA沉默是生物(特別是真核生物)細胞抵御外來核酸(病毒、轉(zhuǎn)座子或轉(zhuǎn)基因)入侵以保持生物自身基因組完整性的一種防御機制。dsRNA為誘發(fā)RNA沉默的關鍵因子。利用DNA重組技術，構(gòu)建病毒基因發(fā)夾結(jié)構(gòu)的RNA(hairpin RNA)(轉(zhuǎn)錄后均形成dsRNA)的植物表達載體，轉(zhuǎn)化植物，獲取抗病毒轉(zhuǎn)基因植物是利用基因工程技術控制植物病毒病害的最有效策略，這一策略通常稱為RNA介導的病毒抗性(RNA-mediated virus resist

2、ance)。RNA介導的病毒抗性具有抗性強、抗性持久、生物安全性高等特點。盡管如此，但由于公眾出于對轉(zhuǎn)基因植物的生態(tài)風險和食品安全性的考慮，抗病毒轉(zhuǎn)基因植物的應用仍然受到極大地限制。新近的研究表明，通過細菌原核表達dsRNA同樣能夠干擾植物病毒的侵染。與獲得抗病毒轉(zhuǎn)基因植物相比，利用細菌表達病原dsRNA沉默病毒基因的表達具有更高的生物安全，更易被接受。
　　 煙草病毒病是全世界煙草栽培區(qū)發(fā)生普遍、危害嚴重的一大類病害。其中分布

3、廣、危害嚴重的有馬鈴薯Y病毒(PVY)、煙草花葉病毒(TMV)等。在田間，病毒病多混合發(fā)生，給煙草生產(chǎn)帶來巨大損失。病害流行的年份，由病毒病造成的煙葉產(chǎn)量損失可達30％～50％，個別地塊甚至絕產(chǎn)。本研究以PVY和TMV的部分功能基因的熱點位置為靶序列構(gòu)建hpRNA載體，利用原核表達dsRNA的策略，比較PVY不同功能基因及同一功能基因的不同區(qū)段的抗病效果，并探討利用該策略同時抗兩種病毒的基因投遞方式對抗病效果的影響進行，為利用該策略抗植

4、物病毒的研究提供了理論依據(jù)。主要研究結(jié)果和結(jié)論如下：
　　 (1)原核表達馬鈴薯Y病毒基因組不同功能基因的雙鏈RNA抗病毒研究
　　 利用PCR技術擴增PVY外殼蛋白基因(Coat Protein，CP)、復制酶基因(Nuclear Inclusion Protein b，NIb)和輔助蛋白(Helper Component Protein，HC-Pro)基因中間區(qū)域長度為600bp的cDNA片段，構(gòu)建發(fā)夾RNA(hpR

5、NA)結(jié)構(gòu)的原核表達載體，轉(zhuǎn)入M-JM1091acY菌株中，經(jīng)IPTG誘導，均可表達600bp的dsRNA，證明所構(gòu)建的dsRNA表達載體正確。
　　 用原核表達PVY外殼蛋白基因、復制酶基因和輔助蛋白基因的dsRNA處理煙草植株，進行抗病性鑒定。檢測結(jié)果顯示，原核表達PVY病毒不同功能基因的dsRNA均能保護植物抵抗PVY病毒的侵染，但介導的抗病性存在著差異。其中來源于復制酶基因的dsRNA介導的抗病效果最好，72％左右的處理

6、植株表現(xiàn)為抗病；來源于衣殼蛋白基因的dsRNA介導的抗病效果較好，56％的處理植株表現(xiàn)為抗??；而來源于蚜傳輔助蛋白基因的dsRNA介導的抗病效果較差，表現(xiàn)為抗病植株占處理植株的比例為46％。
　　 (2)原核表達馬鈴薯Y病毒NIb基因的不同區(qū)段的雙鏈RNA抗病毒研究
　　 根據(jù)已克隆的馬鈴薯Y病毒壞死株系(PVYN)的復制酶(NIb)基因序列設計引物，利用PCR擴增NIb基因的5’端、中間、3’端各500bp cDNA區(qū)

7、段，分別反向插入原核表達載體pGEM-GUS中，構(gòu)建了3個hpRNA結(jié)構(gòu)的原核表達載體pGEMNIb-1、pGEMNIb-2和pGEMNIb-3。經(jīng)IPTG誘導，在大腸桿菌M-JM1091acY菌株中可表達產(chǎn)生500bp的核酸片段，經(jīng)DNase和RNaseA消化處理，證實為dsRNA。
　　 提取表達的PVYNIb基因不同區(qū)段的dsRNA處理煙草，進行抗病毒試驗，結(jié)果顯示，表達NIb基因不同區(qū)段的dsRNA均能保護植物抵抗病毒的

8、侵染，但區(qū)段間存在顯著差異，中間區(qū)段效果最好，抗性植株的比例為66％；3’端次之，抗性植株的比例為52％；5’端區(qū)段效果最差，抗性植株的比例僅為34％。Northernblot分析結(jié)果表明：目的片段轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的積累量與植株的抗病性呈負相關，證明所獲得的抗病性是RNA介導的，21～25nt的siRNAs是RNA沉默的效應分子。
　　 (3)原核表達PVY、TMV的dsRNA多抗病毒研究
　　 基于前期研究結(jié)果，選取了抗病效果

9、較好的PVY的CP和NIb，TMV的CP和MP基因熱點位置序列，構(gòu)建了包含PVY、TMV的單病毒cDNA區(qū)段及2種病毒嵌合基因cDNA區(qū)段的6個hpRNA載體，IPTG誘導目的dsRNA表達，比較單病毒dsRNA的混合物和病毒嵌合基因的dsRNA的抗病效果。結(jié)果顯示：兩種原核表達的dRNA投遞策略均能夠同時介導對PVY、TMV兩種病毒的抗性，但單病毒dsRNA的混合物較兩種病毒嵌合基因的dsRNA具有更好地保護效果，最佳組合抗病效果為4