松果體激素的化學(xué)性質(zhì)及其釋放入腦脊液途徑的形態(tài)學(xué)研究.pdf

1、松果體細(xì)胞帶有突起，含有分泌顆粒；而且，支配松果體的神經(jīng)纖維，也可以釋放神經(jīng)肽；因此，松果體內(nèi)肽類物質(zhì)，是位于松果體細(xì)胞，還是位于支配松果體的神經(jīng)纖維，目前仍不十分確切。人們普遍認(rèn)為，肽類激素分泌顆粒，是以胞吐分泌的方式釋放；但也有學(xué)者認(rèn)為，肽類激素分泌顆粒的釋放形式，可能存在連同顆粒被膜的整體釋放。由于松果體的毛細(xì)血管為窗孔型，相對缺乏血腦屏障，故多數(shù)學(xué)者認(rèn)為，松果體細(xì)胞釋放的分泌物，立即進(jìn)入血液循環(huán)；也有學(xué)者認(rèn)為，松果體分泌的褪黑素

2、，可以直接釋放到第三腦室或蛛網(wǎng)膜下隙的腦脊液中。對人和牛等的血液和腦脊液中，褪黑素濃度的分析表明，腦脊液中濃度通常高于血液數(shù)倍；所以，褪黑素有可能被直接釋放入腦脊液，從而最快最有效地到達(dá)腦內(nèi)的作用靶點(diǎn)。 本研究課題，旨在探討松果體肽類激素的化學(xué)性質(zhì)和釋放形式，觀察松果體分泌物直接釋放到蛛網(wǎng)膜下隙腦脊液途徑的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)；為進(jìn)一步闡明松果體的功能，也為臨床相關(guān)疾病的診治，提供形態(tài)學(xué)依據(jù)。 一、大鼠松果體細(xì)胞原代培養(yǎng)體系的建立

3、 目的：建立體外培養(yǎng)的大鼠松果體細(xì)胞系，觀察培養(yǎng)的松果體細(xì)胞在生長、增殖和功能狀態(tài)等生物學(xué)方面的變化，探討培養(yǎng)松果體細(xì)胞的最佳生長和功能狀態(tài)時機(jī)，為擺脫神經(jīng)及體液等因素對松果體的影響、揭示松果體細(xì)胞自身合成和分泌肽類激素，提供實(shí)驗(yàn)研究依據(jù)。 方法：于春季上午9：00～10：00，將頸椎脫臼法處死的生后1～3天SD乳鼠，經(jīng)75％乙醇消毒后，將顱骨骨片向前掀起，游離粘連于顱骨上的松果體淺部，剝除腦膜及血管；將松果體剪碎，離心后

4、加入0.125％胰酶和0.02％EDTA混合消化液，37℃消化15min；加入含10％新生牛血清、青霉素100IU/ml和鏈霉素100IU/ml的DMEM/F12培養(yǎng)液，終止胰酶消化，制備成單細(xì)胞懸液；接種于放有蓋玻片的六孔板中，置于37℃含5％CO<,2>飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)，在上述混合培養(yǎng)基中培養(yǎng)；分別在接種后的第3、7、10、13天，半量更換混合培養(yǎng)基。每天定時在倒置顯微鏡下觀察其生長情況；取培養(yǎng)第12天的細(xì)胞爬片，行免疫細(xì)胞化學(xué)染

5、色，4％多聚甲醛固定1h，1％TritonX-100室溫30min，一抗為兔抗人多克隆5-HT抗體工作液，4℃過夜；二抗為生物素標(biāo)記的羊抗兔IgG工作液；應(yīng)用辣根過氧化物酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液、DAB顯色；采用O．125％胰酶和0．02％EDTA混合消化液消化法，取培養(yǎng)到第15天的細(xì)胞，2％多聚甲醛和2．5％戊二醛混合固定液，4℃固定3h，進(jìn)行常規(guī)TEM樣品的制備與觀察；取培養(yǎng)第15天的細(xì)胞爬片，1％戊二醛4℃固定lh，梯度乙醇脫水，自

6、然干燥后鍍金，SEM觀察。 結(jié)果：在倒置顯微鏡下觀察顯示，在接種6h后，培養(yǎng)細(xì)胞貼壁；接種后的4天內(nèi)，貼壁細(xì)胞增殖緩慢；接種后第5～6天，細(xì)胞增殖加快；在接種后的第7～8天，出現(xiàn)典型的培養(yǎng)細(xì)胞巢，為較暗的圓形、橢圓形、三角形或多角形的松果體細(xì)胞；在成纖維樣細(xì)胞層的上方中央，呈鋪路卵石樣密集排列；第8～12天，細(xì)胞增殖旺盛，形成許多面積大小不～、細(xì)胞數(shù)量不等的細(xì)胞巢；在第12～15天，分散的、呈片狀的成纖維樣細(xì)胞層逐漸融合，其上的

7、細(xì)胞巢內(nèi)呈鋪路卵石樣排列的細(xì)胞逐漸分散，細(xì)胞巢變得不典型。在細(xì)胞巢的周邊和細(xì)胞巢的空穴內(nèi)，可見少量胞體較大、突起粗大的多邊形神經(jīng)膠質(zhì)樣細(xì)胞。在培養(yǎng)第12天的細(xì)胞爬片上，可見5-HT免疫反應(yīng)陽性細(xì)胞，外觀似雙極神經(jīng)元。TEM觀察顯示，體外培養(yǎng)15天的松果體細(xì)胞內(nèi)，有豐富的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和游離核糖體、密集的線粒體、少量直徑300nm左右的膜包密芯分泌顆粒；在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，還可見到許多大小不等的囊泡。在體外培養(yǎng)15天的細(xì)胞爬片上，SEM觀察顯示，可見

8、梭形和近似球形的松果體細(xì)胞。 結(jié)論：實(shí)驗(yàn)建立了大鼠松果體細(xì)胞體外培養(yǎng)體系，方法簡單易行、價格低廉。在培養(yǎng)的第7～8天，出現(xiàn)典型的細(xì)胞巢，為較暗的圓形、橢圓形、三角形或多角形松果體細(xì)胞，位于成纖維樣細(xì)胞層的上方中央，呈鋪路卵石樣密集排列。培養(yǎng)10～15天時，細(xì)胞生長狀況較好，是進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)研究，或做透射電鏡觀察的最佳時機(jī)。 二、大鼠松果體內(nèi)生長抑素免疫反應(yīng)陽性細(xì)胞和纖維的觀察 目的：由于松果體細(xì)胞帶有突起，又含

9、有分泌顆粒；而且，支配松果體的神經(jīng)纖維，也可以釋放神經(jīng)肽。然而，松果體內(nèi)的肽類物質(zhì)，是位于松果體細(xì)胞內(nèi)，還是位于支配松果體的神經(jīng)纖維內(nèi)，目前仍不十分清楚。 為此，本文旨在探討松果體細(xì)胞，是否自身能夠合成與分泌生長抑素樣抑制性激素。 方法： 1 松果體內(nèi)生長抑素的免疫細(xì)胞化學(xué)觀察取15天齡SD大鼠，于春季上午9：00～11：00，腹腔注射20％烏拉坦麻醉下，左心室插管快速灌流0.9％溫生理鹽水，再用4℃的4％多聚甲

10、醛灌注約1h，斷頭取松果體淺部，置于4℃的4％多聚甲醛中72h；冰凍切片，片厚14 μm；1％TritonX-100室溫30min，一抗為兔抗人多克隆生長抑素抗體工作液，4℃反應(yīng)68h，二抗為生物素標(biāo)記的羊抗兔IgG工作液；辣根過氧化物酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液和DAB顯色。 2 生長抑素在培養(yǎng)大鼠松果體細(xì)胞的表達(dá)取新生SD大鼠松果體，進(jìn)行松果體細(xì)胞培養(yǎng)；取培養(yǎng)第12天的細(xì)胞爬片，4％多聚甲醛中固定1h，1％TritonX-100室

11、溫30min，一抗為兔抗人多克隆生長抑素抗體工作液，4℃反應(yīng)36 h，二抗為生物素標(biāo)記的羊抗兔IgG工作液；辣根過氧化物酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液和DAB顯色。 3 松果體內(nèi)生長抑素的免疫金電鏡觀察取新生SD大鼠，于春季上午9：00～11：00，斷頭，取松果體淺部，4℃的3％多聚甲醛和1％戊二醛中固定60min，4℃的4％多聚甲醛中再固定2h；然后進(jìn)行常規(guī)TEM樣品包埋，超薄切片載于鑷網(wǎng)上；一抗為兔抗人多克隆生長抑素杭體工作液，4℃

12、反應(yīng)70h；膠體金(15nm)標(biāo)記羊抗兔IgG稀釋液(1：10)，37℃反應(yīng)60min；醋酸鈾和枸櫞酸鉛染色，透射電鏡觀察。 結(jié)果： 1 松果體內(nèi)生長抑素的免疫細(xì)胞化學(xué)觀察在15天齡的大鼠松果體，可見數(shù)量稀少的生長抑素免疫反應(yīng)陽性細(xì)胞，其外觀呈橢圓形或三角形，胞體直徑大于其它背景染色細(xì)胞；其中有些陽性細(xì)胞，發(fā)出1～2條細(xì)長、生長抑素免疫反應(yīng)陽性突起，走行于松果體實(shí)質(zhì)細(xì)胞之間。在松果體實(shí)質(zhì)細(xì)胞之間，偶爾可以見到結(jié)節(jié)狀膨大的

13、、生長抑素免疫反應(yīng)陽性纖維。 2 生長抑素在培養(yǎng)大鼠松果體細(xì)胞的表達(dá)在體外培養(yǎng)第12天的細(xì)胞爬片上，可以見到生長抑素免疫反應(yīng)陽性細(xì)胞；其胞體外觀呈圓形、橢圓形、三角形或梭形，從胞體上發(fā)出2～3條細(xì)長的、生長抑素免疫反應(yīng)陽性的突起。 3 松果體內(nèi)生長抑素的免疫金電鏡觀察在生后1天的大鼠，松果體的實(shí)質(zhì)細(xì)胞，主要由松果體細(xì)胞構(gòu)成；其中，只有少量松果體細(xì)胞，含有大型致密核芯分泌顆粒，這些分泌顆粒的數(shù)量較少，在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)呈散在分布或

14、數(shù)個成堆分布。在應(yīng)用樹酯包埋后染色、免疫金電鏡技術(shù)所做的超薄切片上，可在某些松果體細(xì)胞的胞漿內(nèi)，觀察到散在分布的或聚集成堆的標(biāo)記金顆粒。 結(jié)論：在大鼠松果體內(nèi)，存在生長抑素免疫反應(yīng)陽性細(xì)胞和纖維。少量松果體細(xì)胞內(nèi)，含有大型致密核芯分泌顆粒。少量松果體細(xì)胞的胞質(zhì)內(nèi)，含有生長抑素免疫反應(yīng)陽性物質(zhì)。有些體外培養(yǎng)的松果體細(xì)胞，可以合成和分泌生長抑素。 三、大鼠松果體分泌物釋放入蛛網(wǎng)膜下隙腦脊液途徑的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ) 目的：哺乳動

15、物的松果體，富含窗孔型毛細(xì)血管，相對缺乏血腦屏障。因此，多數(shù)學(xué)者認(rèn)為，松果體細(xì)胞釋放的分泌物，立即進(jìn)入血管并經(jīng)血液循環(huán)運(yùn)輸。由于人蛛網(wǎng)膜下隙腦脊液中的褪黑素濃度，顯著高于血液中濃度；因此，松果體分泌物有可能通過腦脊液，直接到達(dá)腦內(nèi)的作用靶點(diǎn)。多數(shù)學(xué)者認(rèn)為，多肽激素的分泌顆粒，是以胞吐分泌的方式釋放，但是也有學(xué)者認(rèn)為，可能存在連同顆粒被膜的整體釋放。為此，本文對大鼠松果體的細(xì)微和超微結(jié)構(gòu)特點(diǎn)進(jìn)行觀察，為松果體細(xì)胞分泌顆粒的釋放形式和轉(zhuǎn)運(yùn)途

16、徑，以及與蛛網(wǎng)膜下隙腦脊液的關(guān)系，提供形態(tài)學(xué)證據(jù)。 方法：于春季上午9：00～11：00，SD大鼠在腹腔注射20％烏拉坦麻醉下，直接斷頭取松果體淺部，12月齡大鼠的松果體，置于4℃的3％多聚甲醛和1％戊二醛溶液中，浸泡固定48 h，然后進(jìn)行常規(guī)’I'EM樣品的制備與觀察；1.5月齡和12月齡的大鼠松果體，置于4℃的2％多聚甲醛和2.5％戊二醛混合固定液中，浸泡固定48h，然后進(jìn)行松果體囊表面的常規(guī)SEM樣品制備與觀察；同時，12

17、月齡大鼠在烏拉坦麻醉下，經(jīng)左心室插管，快速灌注0.9％溫生理鹽水沖洗后，斷頭取松果體淺部，移入1％鋨酸4℃固定1h，然后進(jìn)行。DMSO冷凍割斷法的SEM樣品制備及觀察。 結(jié)論：松果體細(xì)胞表面，可分為結(jié)締組織間隙面、連接面和細(xì)胞間小管面三個功能面；相臨的松果體細(xì)胞之間，局部細(xì)胞膜凹陷，形成互相連通的細(xì)胞間小管。大鼠松果體細(xì)胞分泌顆粒的釋放形式，可能存在連同顆粒被膜的整體釋放。松果體分泌物可通過結(jié)締組織間隙面，釋放入血管周隙；或通過