軟骨細胞接種小孔徑聚乳酸—羥基乙酸共聚物支架的方法選擇.pdf

1、隨著我國交通運輸事業(yè)的飛速發(fā)展和老齡化社會進程的逐步邁進，骨科創(chuàng)傷、感染、退行性變的發(fā)生率逐年增加。以關(guān)節(jié)軟骨損傷為病理基礎(chǔ)的創(chuàng)傷性、退變性骨性關(guān)節(jié)炎等疾患，以及因其所導致的關(guān)節(jié)疼痛和功能障礙已成為目前臨床的常見病與和多發(fā)病。損傷軟骨的修復問題一直是國際骨科學界、運動醫(yī)學界以及生物材料學界研究的熱點與難點問題。
　　 由于軟骨缺乏血管和神經(jīng)的營養(yǎng)作用，因此，損傷后的軟骨再生修復能力很低。目前臨床上常用的修復方法主要為骨髓刺激和移

2、植兩類:前者如鉆孔術(shù)、微骨折術(shù);后者如骨膜移植術(shù)、自體骨軟骨鑲嵌成型術(shù)(Mosaicplasty)以及自體軟骨細胞移植(ACI)術(shù)等。上述已成熟的修復技術(shù)雖然能夠取得一定的臨床療效，但均難以獲得滿意的修復效果，例如，通過刺激骨髓的方法僅能產(chǎn)生纖維軟骨來修復軟骨缺損的區(qū)域;而通過移植技術(shù)修復軟骨缺損，必然會導致供區(qū)損傷，在缺損面積較大的情況下，移植技術(shù)很難滿足臨床需要。
　　 組織工程技術(shù)的飛速發(fā)展為軟骨修復提供了全新的思路和技術(shù)

3、方法，美國食品藥物管理局(FDA)批準組織工程產(chǎn)品應(yīng)用于臨床治療進一步肯定了組織工程產(chǎn)品的臨床治療效果。組織工程研究主要集中在以下方面:種子細胞，組織工程支架，工程化組織的體內(nèi)、外構(gòu)建。聚乳酸-羥基乙酸共聚物[poly(lactic-co-glycolic acid)，PLGA]因具有良好的生物相容性，可調(diào)節(jié)的降解速率以及良好的力學性能等優(yōu)點，已被廣泛應(yīng)用于組織工程領(lǐng)域的研究。組織工程支架的多孔性有利于細胞的增殖、遷移和物質(zhì)交換，同時加

4、速支架的降解過程。骨組織工程所需要的支架孔徑較大，這樣有利于物質(zhì)交換和血管的長入，促進基質(zhì)礦化和骨的生成;而軟骨組織工程所需的支架孔徑一般較小，這樣可以降低局部的氧張力，增加細胞之間的聯(lián)系，更利于有軟骨的再生。因此，文獻報道的旨在成骨的組織工程支架多為大于100μm的大孔徑支架，而旨在再生軟骨的組織工程支架多為小于100μm孔徑的小孔徑支架。其中，細胞接種至支架的孔隙內(nèi)是建立組織工程三維培養(yǎng)的首要環(huán)節(jié)。但是，支架的孔隙內(nèi)存在大量氣體，氣

5、體和液體之間產(chǎn)生的表面張力阻礙細胞的向內(nèi)遷移和物質(zhì)交換，同時支架的疏水性也在一定程度上影響細胞的粘附、遷移和增殖。有研究表明，負壓接種法可以在接種細胞的同時排除支架孔隙內(nèi)的氣體，提高細胞的接種效率，同時證實了100mmHg的負壓可以取得較好的細胞接種效果。但是此前關(guān)于負壓接種法的研究多為旨在成骨的大于100μm孔徑的支架，而適合軟骨組織工程研究的支架孔徑較小，多小于100μm，負壓法應(yīng)用于小于100μm的小孔徑支架其細胞接種的效果如何還

6、未見有相關(guān)報道。因此，研究負壓法是否同樣適用于旨在成軟骨的小孔徑支架是很有必要的。有文獻報道，細胞接種起始外圍的細胞粘附影響細胞向內(nèi)的遷移和生長，小孔徑支架比大孔徑支架更易產(chǎn)生外圍的阻擋作用。對小孔徑PLGA支架采用何種接種方法更為適合，有待進一步研究。
　　 但是，無論組織工程領(lǐng)域的何種研究，其最終目的都是為了提高工程化組織的構(gòu)建效果，新技術(shù)及產(chǎn)品的體內(nèi)效果驗證是必不可少環(huán)節(jié)，因此動物實驗在組織工程研究中是必不可少的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。

7、動物實驗在軟骨組織工程中的主要作用是:方法可行性的驗證、產(chǎn)品安全性的評價、最佳應(yīng)用指標的預(yù)測等等，作為新技術(shù)方法的臨床前研究，起著至關(guān)重要的紐帶作用。但是，在實驗設(shè)計中對動物模型的選擇是困難而又費時的，因此，有必要對組織工程化軟骨構(gòu)建研究中動物模型的選擇原則、已有動物模型各自的特點和應(yīng)用做一綜述。
　　 本文主要比較200-300μm和50-100μm兩種不同孔徑的PLGA支架采用負壓法進行軟骨細胞接種的接種效果;以及通過對比負

8、壓法、注射法、振蕩法對小孔徑PLGA多孔支架進行軟骨細胞接種的效果，探討適用于小孔徑PLGA支架的最佳接種方法。在本文結(jié)尾部分綜述了組織工程化骨與軟骨復合體構(gòu)建研究中動物模型的選擇原則、已有動物模型各自的特點和應(yīng)用情況。
　　 軟骨細胞接種小孔徑聚乳酸-羥基乙酸共聚物支架的方法選擇
　　 第1部分新西蘭大白兔肋軟骨細胞的獲取、擴增與鑒定
　　 目的：
　　 獲取用于作為種子細胞的新西蘭大白兔肋軟骨細胞，并

9、對其進行原代培養(yǎng)、傳代擴大培養(yǎng)與細胞鑒定。
　　 方法
　　 1.新西蘭大白兔原代肋軟骨細胞的獲取、培養(yǎng)與鑒定
　　 無菌條件下取雙側(cè)肋軟骨，剪碎，用0.25％胰蛋白酶37℃條件下消化30min，離心去上清，加0.2％Ⅱ型膠原酶消化6-8h，離心，DMEM漂洗沉淀。將獲得的軟骨細胞接種于培養(yǎng)瓶內(nèi)，添加細胞培養(yǎng)液，置于5％ CO2、37℃孵箱內(nèi)培養(yǎng)，3d后進行第1次換液，進行細胞觀察并用阿利新藍法對軟骨細胞分泌基質(zhì)

10、的能力進行染色鑒定。
　　 2.新西蘭大白兔原代肋軟骨細胞的傳代擴增與鑒定
　　 原代培養(yǎng)細胞達到80％-90％融合后，用0.25％-0.01％胰蛋白酶-EDTA混合液消化細胞，進行傳代擴大培養(yǎng)，培養(yǎng)至第2代進行Ⅱ型膠原免疫組織化學法染色，鑒定其軟骨細胞表型是否仍存在以及Ⅱ型膠原的分泌能力。
　　 結(jié)果
　　 分離培養(yǎng)的新西蘭大白兔原代肋軟骨細胞阿利新藍染色呈陽性，傳代培養(yǎng)至第2代后，Ⅱ型膠原免疫組織化學

11、法染色呈陽性表達，經(jīng)鑒定符合肋軟骨細胞特征。
　　 結(jié)論
　　 兩步酶消化法能夠獲取實驗要求的肋軟骨細胞，傳代培養(yǎng)至第2代仍保持其透明軟骨細胞表型。
　　 第2部分支架的孔徑對軟骨細胞負壓法接種效果的影響
　　 目的：
　　 比較200-300μm和50-100μm兩種不同孔徑的聚乳酸-羥基乙酸共聚物[poly(lactic-co-glycolic acid)，PLGA]支架采用負壓法進行軟骨細胞

12、接種的接種效果。
　　 方法
　　 運用負壓法分別對上述兩種孔徑的PLGA支架進行第2代軟骨細胞接種。200-300μm組為A組，50-100μm為B組(n=9)。接種48h后，Hoechst33285法檢測支架內(nèi)的DNA含量并通過支架的干重進行標準化(ng/mg)，以檢測細胞的接種效率;接種含有異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC)的無細胞纖維蛋白凝膠，觀察凝膠分布，以證實凝膠

13、是否會阻塞支架的孔徑;硬組織切片，4'，6-二脒基-2-苯基吲哚(4'，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)染色觀察支架內(nèi)的細胞分布;接種7d后，掃描電鏡(SEM)觀察支架外周和內(nèi)部的軟骨細胞形態(tài);alamarblue法檢測兩組支架內(nèi)細胞的增殖趨勢，時間點為接種后1d、3d、5d、7d、9d。
　　 結(jié)果
　　 DNA定量結(jié)果顯示A組的DNA含量為498.51±40.18 ng/mg，B組的D

14、NA含量為657.32±89.68 ng/mg，A組＜B組(t=2.799，P=0.049);A組和B組的纖維蛋白凝膠均能實現(xiàn)在支架內(nèi)的均勻分布;DAPI染色結(jié)果顯示，A組支架內(nèi)軟骨細胞分布較為均勻，而B組的細胞多分布在支架的外周;掃描電鏡結(jié)果顯示A組支架孔隙內(nèi)有較多的軟骨細胞黏附，而B組支架內(nèi)鮮有細胞附著;增殖實驗結(jié)果顯示A組和B組增殖趨勢一致，后期A組增殖較快，兩組至第9d時細胞量差異無統(tǒng)計學意義(t=2.246，P=0.088)。

15、
　　 結(jié)論
　　 負壓法應(yīng)用于200-300μm的大孔徑PLGA支架可以取得較好的接種效果，但是其不適用于對50-100μm的小孔徑PLGA支架進行軟骨細胞接種。
　　 第3部分軟骨細胞接種小孔徑PLGA支架的方法選擇
　　 目的：
　　 比較負壓法、注射法、振蕩法對50-100μm小孔徑PLGA多孔支架進行軟骨細胞接種的效果，探討其最佳接種方法。
　　 方法
　　 分離培養(yǎng)新西

16、蘭大白兔肋軟骨細胞，傳代培養(yǎng)至第2代，使用纖維蛋白原溶液混懸細胞，采用負壓法、注射法、振蕩法(n=9)對50～100μm孔徑（孔隙率92％）的PLGA支架進行軟骨細胞接種。接種48 h后，Hoechst33258法檢測支架內(nèi)DNA含量，用支架的干重進行標準化(ng/mg);硬組織切片、DAPI染色觀察支架內(nèi)細胞分布。接種含F(xiàn)ITC的無細胞纖維蛋白原，觀察凝膠分布。培養(yǎng)7d后，掃描電鏡觀察支架表面及內(nèi)部的細胞形態(tài);部分支架(n=3)植入裸

17、鼠皮下，8周后取出做石蠟切片，進行甲苯胺藍、Ⅱ型膠原免疫組織化學法染色，使用Image-Pro Plus6.0軟件分析染色后圖像的累計光密度值，評價體內(nèi)成軟骨效果。
　　 結(jié)果
　　 負壓組DNA含量為(657.32±89.68) ng/mg，注射組為(755.79±80.50)ng/mg，振蕩組為(650.18±106.33) ng/mg，各組間差異無統(tǒng)計學意義(F=1.214，P=0.361);DAPI染色顯示注射組