RECK基因在胃癌中的表達(dá)及其對胃癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響的研究.pdf

1、第一部分:RECK基因在胃癌中的表達(dá)及臨床意義的實(shí)驗(yàn)研究 目的:檢測基質(zhì)金屬蛋白酶抑制基因RECK(reversion-inducing-cysteine-richproteinwithKazalmotifs，RECK)及MMP-9在胃癌組織和正常胃組織中mRNA的表達(dá)水平并探討其臨床意義。 方法:采用逆轉(zhuǎn)錄—聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)，檢測47例胃癌患者的腫瘤組織和正常胃組織中RECK基因及MMP-9mRNA的表達(dá)。

2、 結(jié)果:47例胃癌患者的正常組織中RECKmRNA的相對表達(dá)量為0.793±0.012，腫瘤組織中的表達(dá)量為0.314±0.076，兩者差異有極顯著性意義(P＜0.01)；正常組織中MMP-9mRNA的相對表達(dá)量為0.225±0.107，腫瘤組織中的表達(dá)量為0.663±0.098，兩者表達(dá)有顯著性差異(P＜0.05)，胃癌組織中RECK基因mRNA的表達(dá)水平與MMP-9mRNA的表達(dá)水平呈正相關(guān)(r=0.55，P＜0.05)；R

3、ECK的表達(dá)水平與腫瘤浸潤深度和周圍臟器侵犯密切相關(guān)(P＜0.05)；RECK表達(dá)水平高于0.314的患者其2年生存率要顯著高于RECK表達(dá)水平低者(P=0.043)。 結(jié)論:胃癌組織中RECK基因的轉(zhuǎn)錄水平顯著降低，RECK基因與MMP-9存在某種共同的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)機(jī)制；RECK基因低表達(dá)的腫瘤具有更強(qiáng)的侵襲能力，其表達(dá)與胃癌患者的預(yù)后密切相關(guān)。RECK基因可能成為判斷胃癌患者預(yù)后的一種新指標(biāo)及腫瘤治療的新靶點(diǎn)。 第二部分

4、:人RECK基因的分子克隆及真核表達(dá)載體的構(gòu)建 目的:克隆人RECK(reversion-inducing-cysteine-richproteinwithKazalmotifs)基因，并構(gòu)建RECK基因的真核表達(dá)載體pcDNA3-RECK。 方法:從人的胎盤組織中提取總RNA，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)擴(kuò)增出人RECK基因；將RECK基因克隆入載體pBluescriptⅡSK+中，陽性克隆經(jīng)酶切、電泳鑒定

5、并測定RECK基因序列確認(rèn)后將pBluescriptⅡSK+-RECK酶切所得RECK基因片段插入真核表達(dá)載體pcDNA3中，構(gòu)建RECK基因的真核表達(dá)載體pcDNA3-RECK并經(jīng)酶切鑒定。 結(jié)果:PCR擴(kuò)增得到了特異性的4.4kb基因片段?；蚱蔚拇笮∨c預(yù)期一致。所獲得的RECK基因測序及BLAST分析證明克隆的人RECK基因序列正確，pcDNA3-RECK經(jīng)酶切后得到5.4kb和4.4kb兩個片段。 結(jié)論:成功的

6、克隆了人RECK基因并正確構(gòu)建了其真核表達(dá)載體pcDNA3-RECK。 第三部分:RECK基因?qū)θ宋赴┘?xì)胞株MKN-45生物學(xué)行為的影響的研究 目的:探討轉(zhuǎn)染外源性的RECK基因?qū)KN-45胃癌細(xì)胞體外及體內(nèi)生物學(xué)活性的影響。 方法:采用脂質(zhì)體Lipofectamine2000介導(dǎo)將真核表達(dá)載體pcDNA3-RECK導(dǎo)入體外培養(yǎng)的MKN-45細(xì)胞，RT-PCR及Westernblot檢測轉(zhuǎn)染前后MKN-45細(xì)胞

7、中RECKmRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)。明膠酶譜試驗(yàn)檢測轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞中MMP-9的活性。細(xì)胞計數(shù)法繪制各組細(xì)胞的生長曲線以觀察RECK基因?qū)?xì)胞增殖能力的影響；利用流式細(xì)胞儀方法檢測轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞凋亡率；Boyden小室實(shí)驗(yàn)計算各組穿膜的細(xì)胞數(shù)以比較轉(zhuǎn)染RECK基因?qū)?xì)胞侵襲能力的變化；比較裸鼠成瘤大小及腫瘤轉(zhuǎn)移的比例；應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法檢測裸鼠腫瘤組織中血管內(nèi)皮細(xì)胞特異性第Ⅷ因子相關(guān)抗原(FⅧRAg)和各組細(xì)胞ICAM-1的表達(dá)，依據(jù)FⅧR

8、Ag的表達(dá)評價腫瘤組織內(nèi)微血管密度(MVD)。 結(jié)果:轉(zhuǎn)染pcDNA3-RECK真核表達(dá)載體后MKN-45細(xì)胞能穩(wěn)定高表達(dá)RECKmRNA和蛋白，而轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組和未轉(zhuǎn)染組未檢測到RECK基因的表達(dá)；轉(zhuǎn)染組中具有生物活性MMP-9的表達(dá)顯著降低(P＜0.05)。轉(zhuǎn)染前后MKN-45細(xì)胞的生長曲線、細(xì)胞體外遷徙能力以及細(xì)胞凋亡率無明顯差異(P＞0.05)，但其體外侵襲能力明顯下降(P＜0.05)；轉(zhuǎn)染RECK組細(xì)胞ICAM-1的表達(dá)

9、顯著減少(P＜0.05)。轉(zhuǎn)染RECK組的成瘤體積與轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組無明顯差異(P＞0.05)，但轉(zhuǎn)染組遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移率顯著低于未轉(zhuǎn)染組(P＜0.05)，轉(zhuǎn)染組腫瘤組織內(nèi)MVD顯著降低(P＜0.01)。 結(jié)論:成功的利用脂質(zhì)體Lipofectamine2000將真核表達(dá)載體pcDNA3-RECK導(dǎo)入倒MKN-45細(xì)胞，經(jīng)過篩選后得到了穩(wěn)定高表達(dá)RECK蛋白的MKN-45細(xì)胞株，RECK基因能顯著抑制MMP-9的活性及ICAM-1的表達(dá)，R

10、ECK的表達(dá)不影響MKN-45細(xì)胞的生長、細(xì)胞體外遷徙能力、細(xì)胞凋亡率及成瘤體積，但可顯著抑制其體外和體內(nèi)的侵襲及轉(zhuǎn)移能力以及抑制腫瘤血管的生成 第四部分:轉(zhuǎn)錄因子Sp1對人胃癌細(xì)胞MKN-45中RECK基因表達(dá)的調(diào)控作用 目的:探討腫瘤壞死因子a(TNF-α)對人胃癌細(xì)胞MKN-45中RECK基因及MMP-9表達(dá)的影響，檢測轉(zhuǎn)錄因子Sp1在調(diào)節(jié)RECK基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控中的作用。 方法:將培養(yǎng)的MKN-45細(xì)胞分為3

11、組：A組1U/ml、5U/ml、10U/ml3種濃度的TNF-α作用人胃癌細(xì)胞MKN-45細(xì)胞株6h；B組用濃度為10U/ml的TNF-α作用MKN-45細(xì)胞1h、2h、4h、6h；C組用1mmol/ml、5mmol/ml、10mmol/ml的二硫代氨基甲酸吡硌烷(pyrrolidinedithiocarbamate，PDTC)與TNF-α(10U/ml)同時作用于MKN-45細(xì)胞6h，RT-PCR法檢測三組細(xì)胞RECK基因mRNA的表

12、達(dá)，凝膠滯留電泳實(shí)驗(yàn)(electrophoreticmobilityshiftassay,EMSA)DNA結(jié)合反應(yīng)檢測細(xì)胞Sp1的活性。 結(jié)果:未處理的MKN-45細(xì)胞不表達(dá)RECKmRNA，隨著TNF-α濃度的增加以及作用時間的延長，RECK基因出現(xiàn)表達(dá)且表達(dá)量顯著增加(P＜0.01)。TNF-α能激活Sp1的活性，PDTC能抑制TNF-α對Sp1的激活以及上調(diào)RECK基因轉(zhuǎn)錄的作用。 結(jié)論:TNF-α可通過激活Sp1