大花羅布麻葉對多巴胺能神經(jīng)的保護作用研究.pdf

1、帕金森癥（Parkinson’s disease, PD）是以腦部黑質(zhì)中多巴胺能（dopaminergic， DA）神經(jīng)元變性、丟失和死亡為病理特征的一類神經(jīng)退行性病變的疾病，患者常常會出現(xiàn)震顫麻痹、姿勢僵硬、行動障礙等癥狀。該病在老年人中發(fā)病率較高，有隨年齡增長而增加的趨勢，是目前僅次于阿爾茨海默氏病（Alzheimer’s disease, AD）的第二大神經(jīng)系統(tǒng)疾病。PD發(fā)病病因目前仍不甚清楚，多數(shù)學(xué)者認為除與年齡高度相關(guān)外，長期

2、與環(huán)境毒素接觸、遺傳和神經(jīng)炎癥等也是導(dǎo)致該病的重要相關(guān)因素。1-甲基-4-苯基吡啶離子（MPP+）能夠選擇性的被多巴胺轉(zhuǎn)運體（DAT）結(jié)合，運送至DA神經(jīng)元，而后通過抑制細胞線粒體復(fù)酶I而干擾呼吸鏈，影響細胞的能量供應(yīng)，同時產(chǎn)生大量超氧陰離子，這些超氧陰離子和一氧化氮反應(yīng)生成過氧亞硝酰陰離子，這些物質(zhì)能夠產(chǎn)生過度氧化應(yīng)激而嚴重損傷細胞導(dǎo)致其死亡。谷氨酸（glutamate, Glu）作為一種極其重要的神經(jīng)遞質(zhì)，過量后能夠抑制內(nèi)源性谷胱甘

3、肽的合成，并伴隨活性氧簇（reactive oxigen spieces, ROS）大量堆積而導(dǎo)致細胞死亡。LPS是一種強烈的炎癥誘導(dǎo)因子，能夠激活神經(jīng)膠質(zhì)細胞，釋放NO，PGE2等多種炎癥因子，使細胞處于過度應(yīng)激狀態(tài)，最終導(dǎo)致死亡。三種物質(zhì)經(jīng)常用來制備DA神經(jīng)受損模型進行PD病理和藥物研究。1-甲基-4苯基-1，2，3，6-四氫吡啶（MPTP）是MPP+的前體物質(zhì)，能夠造成靈長類動物的PD癥狀，最初是在美國吸毒青年中發(fā)現(xiàn)。MPTP本身

4、不具有毒性，高度的親脂性使其很容易通過血腦屏障而進入大腦，在星形膠質(zhì)細胞中被單胺氧化酶（MAO-B）轉(zhuǎn)化為毒性形式MPP+而對DA神經(jīng)元造成損害，出現(xiàn)PD癥狀，作用機制與MPP+細胞損傷模型一致。MPTP是最為常用的致急性PD動物模型藥物。
　　 大花羅布麻葉是傳統(tǒng)的降壓中藥，同時還具有延緩衰老和增強機體免疫力的活性?；瘜W(xué)成分分析表明其中黃酮類成分含量較高，以槲皮素及其苷類為代表成分，研究報道槲皮素等黃酮類物質(zhì)具有神經(jīng)保護作用。

5、近期在對羅布麻抗抑郁作用機制研究中發(fā)現(xiàn)，羅布麻葉水提取物能夠影響多巴胺、5-羥色胺等神經(jīng)遞質(zhì)的分泌。羅布麻與大花羅布麻葉具有類似的化學(xué)成分和藥理活性，但對大花羅布麻并未進行過神經(jīng)系統(tǒng)方面的系統(tǒng)研究。本課題擬對大花羅布麻葉水提取物中的黃酮類化學(xué)成分進行分離鑒定，并研究其對DA神經(jīng)細胞的保護作用，對大花羅布麻的藥理活性進行新的探索研究，為PD的中藥治療積累研究資料。
　　 1．大花羅布麻葉水提取物黃酮類化學(xué)成分分離鑒定和含量測定目的

6、：分離大花羅布麻葉水提取物中黃酮類化學(xué)成分，鑒定化學(xué)結(jié)構(gòu)；以分離得到的單體化合物作為對照品，測定它們在大花羅布麻葉原藥材（E0）、羅布麻霜（E1）、大花羅布麻葉黃酮富集物（E2）中的含量。方法：大花羅布麻葉3kg加水煎煮提取2次，依次加入10、8倍水量，合并提取液，過濾后減壓濃縮至一定體積后，加入95%乙醇至含醇量為20%，過夜沉淀除去少量雜質(zhì)。取上清液濃縮至無醇味后，通過HPD-100型非極性大孔吸附樹脂，以含水乙醇梯度洗脫，收集30

7、%乙醇洗脫物繼續(xù)通過Sephadex-LH 20柱層析，以含水甲醇洗脫。通過對大花羅布麻葉的水提取物進行系統(tǒng)層析后，經(jīng)反復(fù)分離純化得到三個黃色單體化合物。以高效液相色譜法對三個化合物分別在大花羅布麻葉原藥材（E0）、羅布麻霜（E1，大花羅布麻葉水提取物）、大花羅布麻葉黃酮富集物（E2，由E1通過HPD-100型大孔吸附樹脂以30%乙醇洗脫所得）中的含量進行了測定。對于槲皮素的測定采用2005版中國藥典規(guī)定的鹽酸水解后再行測定的方法進行。

8、結(jié)果：經(jīng)過理化性質(zhì)分析和光譜學(xué)確證，參考文獻后確認三個單體化合物分別為槲皮素（Q1）、羅布麻甲素（Q2）和槲皮素-3-O-葡萄糖苷（Q3）。三種物質(zhì)中的含量測定結(jié)果見表1。結(jié)論：大花羅布麻葉水提取物中槲皮素-3-O-葡萄糖苷得率最高，大孔樹脂結(jié)合Sephadex LH-20分離大花羅布麻葉黃酮苷類物質(zhì)得率高于硅膠柱層析法。大花羅布麻相關(guān)藥材中游離槲皮素含量很低，加酸水解后測定其在大花羅布麻葉原藥材、羅布麻霜、大花羅布麻葉黃酮富集物中含量

9、均不低于0.6%，符合藥典要求。
　　 2．大花羅布麻葉的抗氧化能力和對MPP+、谷氨酸（glutamte, Glu）和LPS誘導(dǎo)的DA神經(jīng)損傷的保護作用目的：確證并量化大花羅布麻葉的抗氧化活性；通過小鼠原代中腦神經(jīng)細胞培養(yǎng)實驗，研究從大花羅布麻葉中分離得到的三個單體化合物Q1、Q2、Q3，羅布麻霜（E1）和大花羅布麻葉黃酮富集物（E2），對由MPP+、Glu、LPS誘導(dǎo)的DA神經(jīng)損傷的保護作用；同時分析可能的作用機制。方法：分

10、別以Fulin-Ciocalteu法進行總酚含量測定，DPPH自由基清除實驗和Fe3+還原實驗等不同方法對大花羅布麻相關(guān)藥物的抗氧化能力進行測定。采用羅布麻霜（E1，100、200μg/ml），大花羅布麻葉黃酮富集物（E2，50、100μg/ml）；槲皮素（Q1）、羅布麻甲素（Q2）和槲皮素-3-O-葡萄糖苷（Q3）三個單體化合物5、10、20和40μM；處理于10DIV生長期的小鼠中腦原代神經(jīng)細胞48h，免疫組化染色觀察上述藥物濃度對

11、酪氨酸羥化酶（tyrosine hydroxylase， TH+）表達陽性細胞DA神經(jīng)元和神經(jīng)核陽性（neural nuclei， NeuN+）細胞的影響，分析大花羅布麻葉對小鼠中腦神經(jīng)細胞的作用。同時分別以MPP+（10μM，48h），Glu（500μM，10min），LPS（150μg/ml，48h）三種物質(zhì)為誘導(dǎo)劑，處理相同培養(yǎng)期（10DIV）的小鼠中腦原代神經(jīng)細胞；以前述大花羅布麻相關(guān)藥物濃度對由MPP+，Glu，LPS誘導(dǎo)的D

12、A神經(jīng)損傷進行干預(yù)，免疫組化染色觀察DA神經(jīng)元數(shù)量和形態(tài)的變化，分析大花羅布麻葉對三種物質(zhì)誘導(dǎo)的DA神經(jīng)損傷的保護作用。采用Fe3+還原實驗測定MPP+誘導(dǎo)DA細胞損傷模型的細胞培養(yǎng)液的總抗氧化能力，分析大花羅布麻相關(guān)藥物對抗MPP+的作用機制。以Griess試劑測定由LPS誘導(dǎo)DA細胞損傷模型的細胞培養(yǎng)液中NO含量，分析大花羅布麻對抗LPS的作用機制。結(jié)果：三種不同的抗氧化實驗結(jié)果均顯示E1和E2以及三個單體化合物都具有顯著的抗氧化活

13、性，其中Q1的在單體化合物中活性最強，E2的活性強于E1。小鼠原代中腦神經(jīng)細胞培養(yǎng)實驗結(jié)果表明，大花羅布麻葉相關(guān)藥物在上述濃度下，對DA神經(jīng)和NeuN+細胞沒有細胞毒作用，并能夠?qū)A神經(jīng)元纖維的生長有一定促進作用。MPP+、Glu和LPS等三種物質(zhì)對DA神經(jīng)元具有明顯的抑制作用，細胞活度顯著下降，細胞存活率約為50%；經(jīng)與大花羅布麻相關(guān)藥物共同作用后， DA神經(jīng)細胞存活率出現(xiàn)不同程度提高。對細胞培養(yǎng)液的總抗氧化實驗和NO實驗結(jié)果表明，

14、大花羅布麻相關(guān)藥物能提高細胞的總抗氧化能力，并能抑制LPS導(dǎo)致的NO釋放量增多。結(jié)論：大花羅布麻葉相關(guān)藥物對小鼠中腦原代神經(jīng)細胞沒有細胞毒作用，可用于相關(guān)藥理實驗；同時對由MPP+，Glu，LPS誘導(dǎo)的DA神經(jīng)損傷具有保護作用，可能與抗氧化活性和抑制NO等炎癥因子釋放作用有關(guān)。
　　 3．大花羅布麻葉對MPTP型PD小鼠的DA神經(jīng)保護作用目的：以大花羅布麻葉黃酮富集物E2和槲皮素-3-O-槐糖苷為受試藥物，研究大花羅布麻葉對MP

15、TP型PD小鼠DA神經(jīng)的保護作用。方法：取MPTP（30mg/kg體重）作為小鼠（C57/Bl）PD模型制備藥物，大花羅布麻葉黃酮富集物（E2，250mg/kg體重），槲皮素-3-O-槐糖苷（Q3，25mg/kg體重）作為干預(yù)藥物，先期給予干預(yù)藥物灌胃7天，第8天開始進行模型制備，腹腔注射給藥，連續(xù)5天，累積給藥150mg/kg，同時灌胃給與干預(yù)藥物；最末一次給藥第2天進行行為學(xué)參數(shù)測定，次日處死動物，分離腦部兩側(cè)紋狀體進行多巴胺含量測

16、定；取中腦進行石蠟切片，免疫組化染色后觀察黑質(zhì)致密部（Substantia nigra， SN）病理變化和DA神經(jīng)元數(shù)量和形態(tài)變化。行為學(xué)參數(shù)包括小鼠自主活動次數(shù)和爬桿實驗。結(jié)果：MPTP能夠顯著減少小鼠自主活動次數(shù)和延長爬桿時間，降低紋狀體中多巴胺含量，黑質(zhì)中DA神經(jīng)元數(shù)量減少，膠質(zhì)細胞增多。給予大花羅布麻兩個相關(guān)藥物干預(yù)后，Q3組顯示出具有對抗MPTP產(chǎn)生的PD樣癥狀，能夠改善小鼠的運動能力，增加紋狀體中多巴胺含量，同時黑質(zhì)中受損的

17、神經(jīng)細胞有所減少，膠質(zhì)細胞增生程度減輕。而E2組在相同實驗條件下，沒有顯示出明顯的保護作用。結(jié)論：大花羅布麻葉中分離得到的槲皮素-3-O-槐糖苷對MPTP型PD小鼠的DA神經(jīng)損傷具有一定的保護作用。
　　 本文建立了對大花羅布麻相關(guān)藥物中槲皮素-3-O-槐糖苷和羅布麻甲素同時測定的HPLC分析方法，結(jié)果顯示槲皮素-3-O-槐糖苷含量較高。采用大花羅布麻相關(guān)藥物進行的小鼠原代中腦細胞培養(yǎng)實驗結(jié)果表明，大花羅布麻沒有細胞毒作用，并能