靈芝與羅布麻提取物對(duì)神經(jīng)元缺氧復(fù)氧損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制的離體研究.pdf

1、腦缺血后的病理生理過(guò)程復(fù)雜,腦缺血再灌注損傷級(jí)聯(lián)反應(yīng)其中一環(huán)是細(xì)胞凋亡,抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡有利于缺血性腦血管病的治療。中藥活性成分的多樣性常常與損傷級(jí)聯(lián)的復(fù)雜性具有針對(duì)效應(yīng)。靈芝和羅布麻是我國(guó)傳統(tǒng)中藥的珍品,國(guó)內(nèi)外的研究表明:靈芝多糖、靈芝甾醇及羅布麻總黃酮可能通過(guò)抑制氧化應(yīng)激對(duì)腦缺血有保護(hù)作用。氧化應(yīng)激反應(yīng)是導(dǎo)致凋亡的最重要途徑之一。因此,本文研究靈芝及羅布麻提取物抗凋亡作用及其可能機(jī)制。
　　 第一部分:靈芝提取物(Ganod

2、ermalucidiumextract,GLE)對(duì)神經(jīng)元缺氧復(fù)氧損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制研究
　　 目的研究GLE對(duì)原代大鼠皮層神經(jīng)元OGD損傷模型的影響,在細(xì)胞水平探討GLE神經(jīng)保護(hù)作用的科學(xué)機(jī)制。
　　 方法新生SD大鼠的皮層神經(jīng)元原代培養(yǎng)至第7天,GLE預(yù)處理神經(jīng)元OGD模型。選取OGD復(fù)氧后的0h、3h、6h、12h、24h、48h、72h作為觀察點(diǎn),觀察GLE干預(yù)后對(duì)各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞形態(tài)學(xué)、細(xì)胞毒作用、細(xì)胞線粒體

3、活性、細(xì)胞凋亡率及凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)量(caspase-3、caspase-8、caspase-9、bcl-2和Bax)的影響。細(xì)胞形態(tài)學(xué)采用倒置相差顯微鏡觀察;細(xì)胞毒作用采用LDH釋放測(cè)定:細(xì)胞線粒體活性采用XTT檢測(cè)分析;細(xì)胞凋亡率采用流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè):蛋白質(zhì)表達(dá)水平分析采用westernblot。
　　 結(jié)果一.光鏡形態(tài)學(xué)觀察:OGD復(fù)氧后3h開(kāi)始,神經(jīng)元損傷進(jìn)行性加重,OGD復(fù)氧后72h時(shí)損傷最明顯,GLE能減輕缺氧復(fù)氧

4、對(duì)神經(jīng)元的損傷。二.LDH的釋放量在OGD復(fù)氧后3h開(kāi)始有所增高,隨復(fù)氧時(shí)間的延長(zhǎng)進(jìn)一步增高,復(fù)氧后72h達(dá)到最高值。各濃度GLE組在OGD復(fù)氧后3h、6h、12h、24h、48h和72h均能明顯減少LDH的釋放,有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05),并隨著濃度的增加及用藥時(shí)間的增加而作用增強(qiáng)。三.OGD復(fù)氧后3h細(xì)胞線粒體活性開(kāi)始逐漸降低,隨復(fù)氧時(shí)間的延長(zhǎng)進(jìn)一步下降,復(fù)氧后72h達(dá)到最低值,各濃度GLE組能增強(qiáng)細(xì)胞活力,并隨著濃度的增加及

5、用藥時(shí)間的增加而作用增強(qiáng)。四.OGD復(fù)氧后24h時(shí),模型組平均凋亡率較正常組顯著增高(P＜0.001),各濃度GLE組平均凋亡率較模型組顯著降低(P＜0.001)。OGD復(fù)氧后72h時(shí),各濃度GLE組平均凋亡率明顯低于模型組(P＜0.001),濃度越高作用越強(qiáng)。五.OGD復(fù)氧后24h時(shí),westernblot結(jié)果顯示模型組caspase-3,caspase-8caspase-9蛋白表達(dá)增高;各濃度的GLE均能抑制caspase-3,ca

6、spase-8的表達(dá);10μg/ml的GLE能抑制caspase-9蛋白的表達(dá),但0.1μg/ml、1μg/m1GLE均未能抑制caspase-9的表達(dá)。另外,模型組Bcl-2蛋白明顯下降,Bax蛋白表達(dá)明顯增高,GLE各濃度組的Bcl-2蛋白的表達(dá)下降不明顯;各濃度的GLE組均能明顯抑制Bax蛋白的表達(dá)。
　　 結(jié)論一.GLE對(duì)OGD皮層神經(jīng)元損傷有顯著的神經(jīng)保護(hù)作用;二.GLE可能通過(guò)抑制caspase-3激活,上調(diào)bcl-

7、2/Bax的比值而減少缺氧復(fù)氧神經(jīng)元凋亡;三.GLE可能通過(guò)下調(diào)caspase-8和caspase-9進(jìn)而抑制caspase-3表達(dá)。
　　 第二部分:羅布麻提取物(Apocynumvenetumleafextract,AVLE)對(duì)神經(jīng)元缺氧復(fù)氧損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制研究
　　 目的研究GLE對(duì)原代大鼠皮層神經(jīng)元OGD損傷模型的影響,在細(xì)胞水平探討GLE神經(jīng)保護(hù)作用的科學(xué)機(jī)制。
　　 方法新生SD大鼠的皮層神經(jīng)元

8、原代培養(yǎng)至第7天,AVLE預(yù)處理神經(jīng)元OGD模型。選取OGD復(fù)氧后的0h、3h、6h、12h、24h、48h、72h作為觀察點(diǎn),觀察GLE干預(yù)后對(duì)各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞形態(tài)學(xué)、細(xì)胞毒作用、細(xì)胞線粒體活性、細(xì)胞凋亡率及凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)量(caspase-3、caspase-8、caspase-9、bcl-2和Bax)的影響。細(xì)胞形態(tài)學(xué)采用倒置相差顯微鏡觀察;細(xì)胞毒作用采用LDH釋放測(cè)定:細(xì)胞線粒體活性采用XTT檢測(cè)分析;細(xì)胞凋亡率采用流式細(xì)胞

9、技術(shù)檢測(cè);蛋白質(zhì)表達(dá)水平分析采用westernblot。
　　 結(jié)果一.光鏡形態(tài)學(xué)觀察:OGD復(fù)氧后3h開(kāi)始,神經(jīng)元出現(xiàn)損傷進(jìn)行性加重,OGD復(fù)氧后72h時(shí)損傷最明顯,500μg/ml和5000μg/mlAVLE干預(yù)組在OGD復(fù)氧后24h至72h有減輕神經(jīng)元損傷的作用。二.LDH的釋放量在OGD復(fù)氧后3h開(kāi)始有所增高,隨復(fù)氧的時(shí)間延長(zhǎng)進(jìn)一步增高,至72h達(dá)到最高值。5000μg/mlAVLE組在OGD復(fù)氧后12h、24h、48h

10、和72h時(shí)均能明顯減少LDH的釋放,500μg/mlAVLE在OGD復(fù)氧后48h、72h能明顯減少LDH的釋放,有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。三.OGD復(fù)氧后3h開(kāi)始細(xì)胞線粒體活性逐漸降低,隨復(fù)氧時(shí)間的延長(zhǎng)進(jìn)一步下降,至72h達(dá)到最低值,5000μg/mlAVLE組在OGD復(fù)氧后12h、24h、48h和72h時(shí)能增強(qiáng)細(xì)胞活力,而500μg/ml在OGD復(fù)氧后48h、72h才體現(xiàn)出增強(qiáng)細(xì)胞活力的作用。四.OGD復(fù)氧后24h時(shí),模型組平

11、均凋亡率較正常組顯著增高(P＜0.001),5000μg/mlAVLE組平均凋亡率較模型組顯著降低(P＜0.001),但50μg/m1和500μg/mlAVLE與模型組相比無(wú)明顯差異;OGD復(fù)氧后72h時(shí),500μg/mlAVLE組和5000μg/mlAVLE組的平均凋亡率均較模型組顯著降低(P＜0.05),50μg/mlAVLE與模型組相比無(wú)明顯差異。五.OGD復(fù)氧后24h時(shí),westernblot結(jié)果顯示模型組caspase-3,c

12、aspase-8caspase-9蛋白表達(dá)增高;5000μg/mlAVLE能抑制caspase-3,caspase-8的表達(dá),50μg/ml和500μg/mlAVLE抑制效果不明顯;各濃度的AVLE均未能抑制caspase-9的表達(dá)。另外,模型組Bcl-2蛋白明顯下降,Bax蛋白表達(dá)明顯增高,AVLE各濃度組的bcl-2蛋白表達(dá)均明顯下降;5000μg/mlAVLE能明顯抑制Bax蛋白的表達(dá),但50μg/ml和500μg/mlAVLE對(duì)