消痰散結(jié)方對裸鼠人胃癌模型淋巴管生長因子影響的實驗研究.pdf

1、淋巴轉(zhuǎn)移是胃癌轉(zhuǎn)移的主要途徑之一，也是影響術(shù)后復(fù)發(fā)及患者生存率的重要因素，有研究發(fā)現(xiàn)，在發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的腫瘤中，常有淋巴管的增生和擴(kuò)張，表明淋巴管生成在腫瘤淋巴轉(zhuǎn)移過程中起著不容忽視的作用。
　　 導(dǎo)師魏品康教授積數(shù)十年臨床經(jīng)驗，在總結(jié)前人理論基礎(chǔ)上，構(gòu)建胃癌“痰證學(xué)說”，認(rèn)為“痰”是腫瘤發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵物質(zhì)基礎(chǔ)，因此提出“消痰散結(jié)”作為胃癌的核心治則，創(chuàng)立“消痰散結(jié)方”并應(yīng)用于臨床，取得了明顯療效。
　　 我科前

2、期研究發(fā)現(xiàn)消痰散結(jié)方通過多靶點，多途徑抑制腫瘤增殖，預(yù)防腫瘤復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移，但該方對于胃癌淋巴轉(zhuǎn)移這一重要轉(zhuǎn)移途徑研究尚未深入，故本課題在前期研究的基礎(chǔ)上，通過復(fù)制裸鼠人胃癌MKN-45原位移植模型，觀察消痰散結(jié)方對胃癌淋巴管生長因子表達(dá)的影響，進(jìn)一步探討消痰散結(jié)方在防治胃癌淋巴轉(zhuǎn)移方面的作用機(jī)理。
　　 目的:通過復(fù)制建立裸鼠人胃癌MKN-45原位移植瘤模型，觀察腫瘤生長、轉(zhuǎn)移情況，計算抑瘤率，并通過運用EnVision、RT-P

3、CR等方法，檢測消痰散結(jié)方對腫瘤組織中VEGF-C，VEGF-D和VEGFR-3蛋白和mRNA表達(dá)的調(diào)控作用，探討消痰散結(jié)方在防治腫瘤淋巴轉(zhuǎn)移方面的作用機(jī)制。
　　 方法:
　　 1.選取經(jīng)傳代后生長良好的人胃癌MKN-45細(xì)胞瘤株，將其移植到BALB/C裸小鼠胃大彎近胃竇旁，建立裸鼠人胃癌移植瘤模型。定期觀察裸鼠全身情況和腹部瘤塊生長特征，待動物出現(xiàn)衰竭征象時處死，解剖觀察移植瘤局部生長情況。
　　 2.40只

4、BALB/C雄性裸小鼠，采用隨機(jī)數(shù)字表法分為：生理鹽水組、5-Fu組、欖香烯組和消痰散結(jié)方組，術(shù)后48h后給予不同的干預(yù)：分別給予生理鹽水0.4ml灌胃，1/日；5-Fu稀釋液0.2ml腹腔注射(60mg·kg1·w-1)，1/周×3周；欖香烯稀釋液0.4ml(2.5mg/ml)灌胃，1/日；消痰散結(jié)方0.4ml灌胃，1/日；給藥時間為期6周，定期觀察裸鼠全身情況、體重變化和腹部體征。
　　 3.第6周實驗結(jié)束時，麻醉后犧牲、解

5、剖實驗動物，觀察移植瘤局部生長情況及周圍組織轉(zhuǎn)移情況，剝?nèi)×鼋M織，稱取瘤重，計算抑瘤率。行HE染色，對腫瘤進(jìn)行病理診斷。
　　 4.取瘤組織，行EnVision免疫組化方法，半定量分析和比較腫瘤組織VEGF-C，VEGF-D和VEGFR-3蛋白的表達(dá)，計數(shù)LMVD，分析腫瘤微淋巴管生成的情況。
　　 5.取瘤組織抽提總mRNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA行RT-PCR檢測，從mRNA水平檢測和比較VEGF-C，VEGF-D和VE

6、GFR-3 mRNA的表達(dá)變化。
　　 結(jié)果:
　　 1.成功建立裸鼠人胃癌MKN-45原位移植瘤模型。移植術(shù)后10天左右左上腹部可捫及直徑約為5mm左右質(zhì)地較硬的結(jié)節(jié)，隨后結(jié)節(jié)逐漸增大，6周時部分荷瘤鼠出現(xiàn)消瘦、行動遲緩等衰竭癥狀，原位移植瘤突起于腹壁，質(zhì)硬，部分動物瘤體突出至皮下，瘤塊透壁可見，解剖后可見胃壁上有灰白色魚肉狀的腫瘤組織，呈實質(zhì)性，膨脹性生長，有包膜，表面多呈橢圓形結(jié)節(jié)狀，高低不平，質(zhì)地較硬，粘膜下有血

7、管走行，胃被包繞在瘤塊中。部分原位瘤與肝、脾及腹壁粘連。裸鼠移植瘤原位成瘤率100％，HE染色證實為低分化腺癌。
　　 2.各組動物均可觀察到腹腔淋巴結(jié)腫大，其中5-Fu組，欖香烯組，消痰散結(jié)方組出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移比率分別為60％，40％，40％，明顯低于生理鹽水組90％。
　　 3.消痰散結(jié)方對MKN-45荷瘤小鼠腫瘤生長抑制情況表明：5-Fu組，欖香烯組，消痰散結(jié)方組的抑瘤率分別為66.5％、51.0％，57.1％。5-

8、Fu組，欖香烯組，消痰散結(jié)方組的平均瘤重明顯小于生理鹽水組(P＜0.01)；消痰散結(jié)方組平均瘤重與5-Fu組，欖香烯組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，5-Fu組平均瘤重與欖香烯組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 4.消痰散結(jié)方對移植瘤組織中VEGF-C蛋白及mRNA表達(dá)的影響：
　　 (1)消痰散結(jié)方對移植瘤組織中VEGF-C蛋白表達(dá)的影響：與生理鹽水組相比，消痰散結(jié)方組、5-Fu組、欖香烯組均可明顯降

9、低VEGF-C的陽性表達(dá)(P＜0.01)，三組藥物之間互相比較：消痰散結(jié)方組與欖香烯組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)；消痰散結(jié)方組、欖香烯組與5-Fu組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。
　　 (2)消痰散結(jié)方對移植瘤組織中VEGF-C mRNA表達(dá)的影響：在VEGF-C mRNA的表達(dá)上消痰散結(jié)方組、5-Fu組、欖香烯組的cDNA擴(kuò)增條帶面積灰度值均較生理鹽水組明顯下調(diào)，(P＜0.05)，三組藥物之間互相比較差異

10、均無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。
　　 5.消痰散結(jié)方對移植瘤組織中VEGF-D蛋白及mRNA表達(dá)的影響：
　　 (1)消痰散結(jié)方對移植瘤組織中VEGF-D蛋白表達(dá)的影響：與生理鹽水組相比，消痰散結(jié)方組、5-Fu組、欖香烯組均可明顯降低VEGF-D的陽性表達(dá)(P＜0.01)，三組藥物之間互相比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。
　　 (2)消痰散結(jié)方對移植瘤組織中VEGF-D mRNA表達(dá)的影響：在VEGF-

11、D mRNA的表達(dá)上消痰散結(jié)方組、5-Fu組、欖香烯組的cDNA擴(kuò)增條帶面積灰度值均較生理鹽水組明顯下調(diào)，(P＜0.05)，三組藥物之間互相比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。
　　 6.消痰散結(jié)方對移植瘤組織中VEGFR-3蛋白及mRNA表達(dá)的影響：
　　 (1)消痰散結(jié)方對移植瘤組織中VEGFR-3蛋白表達(dá)的影響：與生理鹽水組相比，消痰散結(jié)方組、5-Fu組、欖香烯組均可降低VEGF-3的陽性表達(dá)(P＜0.05)，

12、消痰散結(jié)方組與5-Fu組、欖香烯組相比，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。
　　 (2)消痰散結(jié)方對移植瘤組織中VEGFR-3 mRNA表達(dá)的影響：在VEGFR-3 mRNA的表達(dá)上消痰散結(jié)方組、5-Fu組、欖香烯組的cDNA擴(kuò)增條帶面積灰度值均較生理鹽水組明顯下調(diào)(P＜0.05)，三組藥物之間互相比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。
　　 7.消痰散結(jié)方對移植瘤組織中微淋巴管密度的影響：各組LMVD值計數(shù)分別為生

13、理鹽水組17.43±1.79，5-Fu組13.33±2.71，欖香烯組10.20±3.64，消痰散結(jié)方組12.23±3.21，與生理鹽水組相比較，消痰散結(jié)方組、5-Fu組、欖香烯組均可明顯降低移植瘤組織中的微淋巴管密度(P＜0.05)，三組藥物之間互相比較：消痰散結(jié)方組與5-Fu組、欖香烯組相比差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 1.消痰散結(jié)方對裸鼠人胃癌MKN-45原位移植瘤增殖和轉(zhuǎn)移具有明顯抑制