消痰散結(jié)方對胃癌P16基因甲基化的影響.pdf

1、胃癌是一種常見的惡性腫瘤，在我國胃癌的發(fā)病率居第二位，但死亡率則位居第一，嚴(yán)重危害人類健康。以往認(rèn)為胃癌的發(fā)生是基因遺傳學(xué)改變的結(jié)果。然而，近年來，越來越多的研究表明，表觀遺傳學(xué)改變在腫瘤的發(fā)生過程中起了關(guān)鍵的作用。DNA甲基化是目前研究較多的表觀遺傳機(jī)制，在胃癌的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。現(xiàn)已證實(shí)DNA甲基化是基因突變及缺失之外抑癌基因失活的第3種機(jī)制，而且在某些情況下是其失活的唯一機(jī)制。胃癌發(fā)生過程中，有許多抑癌基因因發(fā)生高甲基化而失

2、活，導(dǎo)致胃癌的發(fā)生。CDKN2A(P16)是已經(jīng)確認(rèn)的抑癌基因，該基因的失活在腫瘤細(xì)胞增生過程中起著重要作用。P16基因的失活與胃癌、卵巢癌、肺癌等多種腫瘤發(fā)生密切相關(guān)。在胃癌中已被證實(shí)P16基因啟動子區(qū)域異常甲基化是其失活的主要機(jī)制。
　　 基因甲基化可以抑制基因表達(dá)，但又是一種可逆的表觀遺傳學(xué)改變。目前，針對抑癌基因甲基化進(jìn)行有效治療是腫瘤研究的一個熱點(diǎn)。去甲基化劑5-azacytidine和5-Aza-CdR均可使因甲基化

3、而表達(dá)受抑制的抑癌基因重新表達(dá)，從而抑制腫瘤細(xì)胞生長。但是由于這兩種藥物缺乏特異性阻斷效應(yīng)，這限制了其應(yīng)用范圍，目前只用于骨髓增生異常綜合癥的治療，尚未用于胃癌等實(shí)體瘤的治療。探索特異性去甲基化藥物，對于腫瘤的治療有重要的意義。
　　 中醫(yī)藥治療胃腸道腫瘤早有報道，探討中醫(yī)藥對胃腸道腫瘤的作用機(jī)理，有望為胃癌的治療提供新的藥物以及治療思路。關(guān)于中醫(yī)藥的研究甚多，但目前僅有極少幾篇文獻(xiàn)報道中醫(yī)藥影響基因甲基化的研究。魏品康教授提出

4、了腫瘤的“痰污染學(xué)說”，在此學(xué)說的指導(dǎo)下，創(chuàng)立經(jīng)驗(yàn)方消痰散結(jié)方，臨床治療胃癌效果明顯。本課題擬從表觀遺傳學(xué)角度著手，初步探索消痰散結(jié)方對胃癌中P16基因甲基化的影響，以便闡明消痰散結(jié)方的作用機(jī)理；同時，為研究中醫(yī)藥與基因甲基化的關(guān)系提供理論基礎(chǔ)。
　　 目的:通過體外用含藥血清干預(yù)胃癌細(xì)胞系，體內(nèi)用消痰散結(jié)方煎劑給裸鼠人胃癌原位移植瘤模型灌胃，探討消痰散結(jié)方對胃癌細(xì)胞系以及裸鼠原位移植瘤模型基因甲基化的影響；運(yùn)用CCK-8法、R

5、T-PCR；Methylight分子生物學(xué)方法，由定性到定量研究消痰方對腫瘤細(xì)胞系以及腫瘤組織中抑癌基因P16 mRNA表達(dá)以及DNA甲基化水平的影響，從表觀遺傳學(xué)角度探討消痰散結(jié)方抗腫瘤的作用機(jī)理。
　　 方法:
　　 1、6周齡SD雄性大鼠10只，體重350g±20g，隨機(jī)分成空白對照組(生理鹽水)、消痰散結(jié)方組(消痰散結(jié)方水煎劑)，灌胃給藥5日后股動脈取血制備藥物血清。
　　 2、人胃癌細(xì)胞系MKN45，B

6、GC823隨機(jī)分成4組，1)藥物血清組，每孔加入消痰散結(jié)方藥物血清20μl；2)5-Aza-CdR組：每孔加5-Aza-CdR20μl，藥物濃度為5μmol/L；3)空白血清組，每孔加入無藥血清20μl；4)空白對照組，不加任何藥物。每組設(shè)5個復(fù)孔，置37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h、48 h、72 h后，每孔加入CCK-810μl，檢測細(xì)胞活力；
　　 3、分別收集藥物作用前和藥物作用72小時后的細(xì)胞，提取總RNA，紫外

7、分光光度儀測純度和濃度，RT-PCR測定P161基因mRNA表達(dá)；
　　 4、收集藥物作用前后的細(xì)胞，用DNA Mini kit試劑盒抽提細(xì)胞DNA，Methylight法測定P16基因甲基化改變；
　　 5、培養(yǎng)人胃腺癌MKN-45細(xì)胞株，裸鼠腋窩皮下注射反復(fù)傳代形成實(shí)體瘤，取第6代瘤塊，造胃癌腫瘤原位移植模型；裸鼠原位移植瘤模型隨機(jī)分成空白對照組、消痰散結(jié)方組，每組10只。于造模成功后72小時開始給藥：消痰散結(jié)方組給

8、予消痰散結(jié)方水煎劑(含生藥量2.51g/ml)，空白對照組給予生理鹽水。每次灌胃0.2ml，每日2次，連續(xù)給藥6周，每周灌6天休息1天，給藥期間觀察裸鼠活動狀況和瘤體生長狀況，給藥最后一天脫頸處死；
　　 6、第6周實(shí)驗(yàn)結(jié)束時取兩組動物腫瘤組織稱取瘤體重量，測定消痰散結(jié)方抑瘤率；
　　 7、第6周實(shí)驗(yàn)結(jié)束時取兩組動物的腫瘤組織，提取總RNA，紫外分光光度儀測總RNA純度和濃度，RT-PCR測定P16基因mRNA表達(dá)；

9、r>　　 8、第6周實(shí)驗(yàn)結(jié)束時，取兩組動物的腫瘤組織；提取DNA，Methylight法測定P16基因甲基化改變。
　　 結(jié)果:
　　 1、血清狀況：
　　 實(shí)驗(yàn)動物生長良好，兩組動物血液分別制備取得20ml無菌藥物血清；
　　 2、抑瘤率：
　　 含藥血清和5-Aza-CdR均可抑制胃癌細(xì)胞株MKN-45及BGC823細(xì)胞增殖，與空白對照組有明顯差異(P＜0.05)，藥物血清組抑瘤率高于5-A

10、za-CdR組。含藥血清作用72小時后抑瘤作用最強(qiáng)，細(xì)胞生長最低降低為76.14％；空白血清組和空白對照組相比較則無明顯差別(P＞0.05)；
　　 3、RT-PCR結(jié)果顯示：
　　 胃癌細(xì)胞系MKN45、BGC823中P16基因弱表達(dá)，通過含藥血清以及5-Aza-CdR作用72小時后，P16基因表達(dá)明顯升高。5-Aza-CdR組P16基因表達(dá)量高于中藥藥物血清組；
　　 4、 Methylight測定P16基因

11、甲基化水平：
　　 結(jié)果表明胃癌細(xì)胞系MKN45、BGC823中P16基因啟動子明顯甲基化(PMR＞4)，經(jīng)過含藥血清以及5-Aza-CdR作用72小時后，P16基因甲基化水平均明顯降低，與對照組比較有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。5-Aza-CdR組P16基因甲基化水平明顯低于藥物血清組(P＜0.05)。在MKN45細(xì)胞中，經(jīng)5-Aza-CdR作用72小時后，無P16基因甲基化條帶擴(kuò)增；
　　 5、動物生長狀況：

12、　　 實(shí)驗(yàn)過程中，術(shù)后第4天空白對照組動物死亡1只，經(jīng)解剖發(fā)現(xiàn)腸粘連梗阻造成。各組標(biāo)本數(shù)分別為空白對照組9只，消痰散結(jié)方組10只。在給藥3周左右空白對照組開始出現(xiàn)活動減少、飲食減少，消瘦等現(xiàn)象；而消痰散結(jié)方組則在4周左右才出現(xiàn)類似情況。空白對照組在造模2周左右在上腹部觸及腫塊，而消痰散結(jié)方組則較晚。給藥6周后，空白對照組出現(xiàn)消瘦，呈弓背，肋骨隱約可見，活動受限遂結(jié)束飼養(yǎng)，斷頸處死動物；
　　 6、消痰散結(jié)方對原位移植瘤的影響：

13、
　　 腫瘤呈實(shí)質(zhì)性圓形或橢圓形，切面呈魚肉狀，表面結(jié)節(jié)狀突起，較大者切開中央有小片漿液樣壞死區(qū)。瘤體稱量結(jié)果顯示消痰散結(jié)方組的抑瘤率為54.82％，與空白對照組相比有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)；
　　 7、RT-PCR結(jié)果顯示：
　　 裸鼠人胃癌原位移植瘤模型中P16基因弱表達(dá)，通過消痰散結(jié)方灌胃6周后，P16基因表達(dá)明顯升高，與空白對照組比較有明顯差異(P＜0.01)；
　　 8、Methylight

14、測定P16基因甲基化水平：
　　 裸鼠人胃癌原位移植瘤模型中P16基因啟動子明顯甲基化(PMR＞4)，通過消痰散結(jié)方灌胃6周后，P16基因甲基化水平均明顯降低，與空白對照組比較有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.01)。
　　 結(jié)論:
　　 1、消痰散結(jié)方含藥血清能抑制胃癌腫瘤細(xì)胞系的增殖；
　　 2、消痰散結(jié)方可抑制裸鼠人胃癌原位移植瘤模型腫瘤的生長；
　　 3、體外及體內(nèi)實(shí)驗(yàn)顯示消痰散結(jié)方能降低P16基因啟