都梁軟膠囊治療偏頭痛的藥效學及其機制研究.pdf

1、背景:
　　本文研究內容屬于重慶華森制藥有限公司委托項目。該制劑為上市中成藥（國藥準字:Z20055185），具有活血通絡、祛風散寒之功效，主治頭痛屬風寒瘀血阻滯脈絡癥者。但該藥缺乏藥效成分含量控制標準，主治頭痛的范圍缺乏現代疾病的限定范圍，缺乏治療偏頭痛的效果驗證及其作用機制闡釋。委托單位擬進行該制劑治療偏頭痛的藥效及其提取物的量效關系研究。該課題所屬項目“中藥大品種都梁軟膠囊技術改造”獲得科技部“重大新藥創(chuàng)制”專項(2010Z

2、X09401-306-3-4)資助。
　　目的:
　　研究都梁軟膠囊提取物改善偏頭痛模型大鼠的量-效關系，并在最佳用藥劑量基礎上，觀察都梁軟膠囊對偏頭痛模型大鼠的治療效果，并對其機制進行探討，為臨床用藥提供現代藥理學實驗依據和作用機制闡釋。
　　方法:
　　1.都梁軟膠囊主要成分的含量檢測:采用高效液相色譜儀對都梁軟膠囊主要成分進行含量檢測。其中，歐前胡素和異歐前胡素:色譜柱（ODS C18柱），流動相（乙腈∶水

3、=52∶48），流速(1mL·min-1)，柱溫(30℃)，檢測波長(248 nm);阿魏酸∶色譜柱（ODS C18柱），流動相（甲醇∶0.1％磷酸=35∶65），流速(1 mL·min-1)，柱溫(30℃)，檢測波長(321 nm)。
　　2.都梁軟膠囊提取物治療偏頭痛模型大鼠的量-效關系研究:SD雄性大鼠90只，180～220 g，隨機分成9組，即正常組、模型組、舒馬普坦組、都梁軟膠囊提取物6個不同劑量(0.13 g·kg-1

4、、0.39 g·kg-1、1.31 g·kg-1、3.93 g·kg-1、13.13 g·kg-1、39.39 g·kg-1)組，每組10只。連續(xù)灌胃給藥7天（給藥量為10 mL·kg-1），正常組和模型組給予等體積的溶媒。第7天給藥30 min后，除正常組外，各組皮下注射硝酸甘油10 mg·kg-1造模，模型組給予等體積的生理鹽水。隨后以30 min為一個觀察時間段，對大鼠造模后0～180 min進行行為學觀察，記錄相關癥狀結果。造模

5、4h后，麻醉，取血，分離血清和血漿，放免法測定血漿降鈣素基因相關肽(CGRP)和內皮素(ET)含量，酶免法測定血清一氧化氮(NO)含量。取血后迅速取腦，分離腦干，稱重，熒光分光光度法測定腦干內5-羥色胺(5-HT)、去甲腎上腺素(NE)、多巴胺(DA)含量。
　　3.都梁軟膠囊改善偏頭痛模型大鼠行為學指標觀察:SD雄性大鼠60只，180～220 g，隨機分成6組，即正常組、模型組、舒馬普坦組、都梁軟膠囊低、中、高劑量（0.44 g

6、·kg-1、1.31 g·kg-1、3.93 g·kg-1）組，每組10只。連續(xù)灌胃給藥7天（給藥量為10 mL·kg-1），正常組和模型組給予等體積的溶媒。第7天給藥30 min后，除正常組外，各組皮下注射硝酸甘油10 mg·kg-1造模，模型組給予等體積的生理鹽水。隨后以30 min為一個觀察時間段，對大鼠造模后0～180 min進行行為學觀察，記錄相關癥狀結果。
　　4.都梁軟膠囊對偏頭痛模型大鼠血液生化指標及腦干單胺類遞質

7、的影響:SD雄性大鼠60只，180～220 g，隨機分成6組，即正常組、模型組、舒馬普坦組、都梁軟膠囊低、中、高劑量(0.44 g·kg-1、1.31g·kg-1、3.93 g·kg-1)組，每組10只。連續(xù)灌胃給藥7天（給藥量為10 mL·kg-1），正常組和模型組給予等體積的溶媒。第7天給藥30 min后，除正常組外，各組皮下注射硝酸甘油10 mg·kg-1造模，模型組給予等體積的生理鹽水。造模4h后，麻醉，取血，分離血清和血漿，放

8、免法測血漿CGRP、ET，紫外分光光度法測血清NO含量。取血后迅速取腦，分離腦干，稱重，熒光分光光度法測定腦干內5-HT、NE、DA含量。
　　5.都梁軟膠囊對偏頭痛模型大鼠炎癥相關因子的影響:SD雄性大鼠60只，180～220 g，隨機分成6組，即正常組、模型組、舒馬普坦組、都梁軟膠囊低、中、高劑量（0.44 g·kg-1、1.31 g·kg-1、3.93 g·kg-1）組，每組10只。連續(xù)灌胃給藥7天（給藥量為10 mL·kg

9、-1），正常組和模型組給予等體積的溶媒。第7天給藥30 min后，除正常組外，各組皮下注射硝酸甘油10 mg·kg-1造模，模型組給予等體積的生理鹽水。造模4h麻醉處死實驗動物，在冰上分離腦干，在4℃預冷的緩沖液中沖冼，并將組織分離成小塊，嚴格按照RIPA裂解液（強）和細胞核蛋白與細胞漿蛋白抽提試劑盒說明書操作，提取腦干組織總蛋白和胞核蛋白，BCA法測胞漿蛋白和核蛋白的含量。Western Blot法測定腦干胞核中核因子-kappaB

10、p65(NF-κB p65)、細胞癌基因fos(c-fos)蛋白的表達，及總蛋白中一氧化氮合成酶(iNOS)、白介素-1β(IL-1β)、環(huán)氧合酶-2(COX-2)的表達。
　　結果:
　　1.都梁軟膠囊主要成分的含量檢測:歐前胡素含量為1.54 mg·g-1，異歐前胡素含量為0.49 mg·g-1，阿魏酸含量為51.46μg·g-1。
　　2.都梁軟膠囊提取物治療偏頭痛模型大鼠的量-效關系研究:
　　在行為學方

11、面，與正常組比較，模型組大鼠在整個觀察時間段(0～180 min)撓頭、爬籠次數顯著性升高(P＜0.01)，并出現耳紅癥狀;與模型組比較，都梁軟膠囊提取物0.13 g·kg-1、0.39 g·kg-1、1.31 g·kg-1、3.93 g·kg-1、13.13 g·kg-1、39.39 g·kg-1組大鼠在造模0～60 min后撓頭、爬籠次數無下降趨勢，兩者比較無顯著性差異(P＞0.05);1.31 g·kg-1、3.93 g·kg-1

12、、13.13 g·kg-1、39.39 g·kg-1組大鼠在造模90～180 min后撓頭、爬籠次數顯著性降低（P＜0.05或P＜0.01），且耳紅和爬籠消失時間顯著縮短(P＜0.01)。
　　在對血液及腦干生化指標影響方面，與正常組比較，模型組血漿CGRP和血清NO顯著性升高，血漿ET和腦干5-HT、NE、DA含量均顯著性降低(P＜0.05或P＜0.01);與模型組比較，都梁軟膠囊提取物1.31 g·kg-1、3.93 g·kg

13、-1、13.13 g·kg-1、39.39 g·kg-1組血漿CGRP和血清NO含量顯著降低(P＜0.05或P＜0.01)，3.93g·kg-1、13.13 g·kg-1、39.39 g·kg-1組血漿ET含量顯著升高(P＜0.01)，1.31、3.93、13.13、39.39 g·kg-1組腦干5-HT、NE含量顯著升高(P＜0.05或P＜0.01)，39.39 g·kg-1組腦干DA含量顯著升高(P＜0.05)。
　　所有評價

14、指標在1.31～39.39 g·kg-1范圍內存在一定的量效關系。
　　3.都梁軟膠囊改善偏頭痛模型大鼠行為學指標觀察:與正常組比較，模型組大鼠在整個觀察時間段(0～180 min)撓頭、爬籠次數顯著性升高(P＜0.01)，并出現耳紅癥狀，顯示模型成功。與模型組比較，都梁軟膠囊0.44 g·kg-1、1.31 g·kg-1、3.93 g·kg-1組大鼠在造模0～60 min后撓頭、爬籠次數無下降趨勢，兩者比較無顯著性差異(P＞0.

15、05);1.31 g·kg-1、3.93 g·kg-1組大鼠在造模60～180min后撓頭、爬籠次數顯著性降低(P＜0.05或P＜0.01)，且耳紅和爬籠消失時間顯著縮短(P＜0.01)。提示都梁軟膠囊在1.31 g·kg-1至3.93 g·kg-1劑量范圍內，給藥7天，能顯著改善造模60～180min偏頭痛模型大鼠行為學異常。
　　4.都梁軟膠囊對偏頭痛模型大鼠血液生化指標及腦干單胺類遞質的影響:與正常組比較，模型組血漿CGRP

16、和血清NO顯著性升高(P＜0.01)，血漿ET及腦干5-HT、NE和DA含量均顯著性降低(P＜0.01)。與模型組比較，都梁軟膠囊0.44 g·kg-1組腦干5-HT、NE、DA含量顯著升高(P＜0.01);1.31 g·kg-1組血漿CGRP和血清NO含量顯著降低(P＜0.01)，腦干5-HT、NE、DA含量顯著升高(P＜0.01);3.93 g·kg-1組血漿CGRP和血清NO含量顯著降低(P＜0.01)，血漿ET、腦干5-HT、N

17、E、DA含量顯著升高(P＜0.01)。提示都梁軟膠囊在0.44 g·kg-1至3.93 g·kg-1劑量范圍內，給藥7天，能顯著改善偏頭痛模型大鼠血液生化指標及腦干單胺類遞質異常。
　　5.都梁軟膠囊對偏頭痛模型大鼠的炎癥相關因子的影響:與正常組比較，模型組大鼠腦干胞核內NF-κB p65、c-fos及總蛋白內iNOS、COX-2、IL-1β的表達水平顯著升高(P＜0.01)。與模型組比較，都梁軟膠囊1.31 g·kg-1、3.9

18、3 g·kg-1組大鼠腦干胞核內NF-κB p65、c-fos及總蛋白內iNOS、COX-2、IL-1β的表達水平顯著降低（P＜0.05或P＜0.01）。提示都梁軟膠囊在1.31 g·kg-1至3.93 g·kg-1劑量范圍內，給藥7天，能顯著改善偏頭痛模型大鼠炎癥相關因子異常。
　　結論:
　　1.建立了都梁軟膠囊主要成分的檢測方法，提高其質量控制標準。
　　2.成功復制了硝酸甘油致偏頭痛大鼠模型，并運用于都梁軟膠囊

19、相關研究中。
　　3.在對都梁軟膠囊提取物治療偏頭痛的量-效關系研究中，都梁軟膠囊提取物0.13 g·kg-1、0.39 g·kg-1組均只有改善相關指標的作用趨勢，但無顯著性差異。其劑量在1.31 g·kg-1～39.39 g·kg-1范圍內有明顯改善相關指標的作用，且呈現出一定的量效關系。其中，39.39 g·kg-1組對部分指標的改善較13.13 g·kg-1組反而降低。
　　4.都梁軟膠囊在1.31 g·kg-1至3

20、.93 g·kg-1劑量范圍內，給藥7天，能顯著改善造模60～180 min偏頭痛模型大鼠行為學異常，改善血液生化指標及腦干單胺類遞質異常，以及改善炎癥相關因子異常。
　　5.都梁軟膠囊可顯著改善偏頭痛模型大鼠的血液和腦組織中，血管舒縮功能和神經痛覺增敏相關指標的異常變化，這可能是其治療偏頭痛的重要作用機制之一。
　　6.在硝酸甘油致偏頭痛模型大鼠的腦干組織中，NF-κB通路介導的相關炎癥因子被激活，這證明了硝酸甘油致偏頭痛