通過(guò)抑制Aurora-B激酶抑制宮頸癌細(xì)胸的生長(zhǎng)及對(duì)順鉑化療敏感性影響的研究.pdf

1、前言及目的：
　　 宮頸癌是女性最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一,嚴(yán)重威脅婦女的身心健康。宮頸癌主要以手術(shù)和放射治療為主,但許多患者就診時(shí)已經(jīng)失去手術(shù)機(jī)會(huì)。隨著腫瘤化學(xué)治療的基礎(chǔ)和臨床研究的迅速進(jìn)展,子宮頸癌新輔助化療(neoadjuvantchemotherapy.NACT)逐漸受到學(xué)者們的重視。以鉑類為基礎(chǔ)的聯(lián)合化療提高了宮頸癌患者的生存期1,但因其對(duì)正常組織的細(xì)胞毒性及獲得性耐藥嚴(yán)重地制約了總體的化療效果,因此,尋找一些對(duì)腫瘤細(xì)胞有相

2、對(duì)選擇性、毒性小、卻有一定療效并能夠增加已有化療藥物的敏感性,是提高宮頸癌尤其是晚期患者生存率的關(guān)鍵。
　　 有絲分裂錯(cuò)誤是基因組不穩(wěn)定的重要原因,與腫瘤生成密切相關(guān)。許多有絲分裂調(diào)節(jié)蛋白在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)紊亂,這些蛋白因此可成為有用的治療靶點(diǎn)。Aurora激酶家族是一組調(diào)節(jié)中心體、微管功能的絲氨酸和蘇氨酸激酶。在細(xì)胞有絲分裂的正常進(jìn)行中發(fā)揮重要的作用。哺乳動(dòng)物細(xì)胞Aurora激酶家族成員的結(jié)構(gòu)和功能在進(jìn)化上保守,根據(jù)該家族各成員

3、在細(xì)胞內(nèi)的定位可分為3種:Aurora-A、Aurora-B、Aurora-C2。Aurora-B是染色體的過(guò)客蛋白3-4,定位于有絲分裂早期的染色體的著絲粒區(qū)域,分裂后期則從著絲粒移至嵌入紡錘體赤道板的微管。隨著紡錘體的延伸,細(xì)胞開(kāi)始胞質(zhì)分裂,Aurora-B集聚至紡錘體中央和細(xì)胞皮層的裂溝內(nèi)移部位,最終在中間體聚集,Aurora-B與另3個(gè)染色體過(guò)客蛋白一內(nèi)著絲粒蛋白(INCENP)、survivin和borealin結(jié)合,該復(fù)合體

4、的主要功能是保證Aurora-B在有絲分裂前和有絲分裂期間正確定位并激活,對(duì)于染色體正確排列和分離有著非常重要的作用。Aurora-B是有絲分裂中組蛋白H3的10位絲氨酸磷酸化所必需的激酶,組蛋白H3磷酸化主要由Aurora-B激酶控制,對(duì)于染色體濃縮非常重要5-6,當(dāng)組蛋白H3磷酸化被抑制時(shí),染色體濃縮被抑制,阻礙細(xì)胞進(jìn)入有絲分裂,組蛋白H3磷酸化可作為Aurora-B的直接的下游靶分子來(lái)衡量Aurora-B激酶抑制劑對(duì)細(xì)胞是否起作用

5、的一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)。
　　 研究發(fā)現(xiàn)Aurora-A、Aurora-B在肺癌、前列腺癌、結(jié)直腸癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、食管癌等7-13許多惡性腫瘤中存在過(guò)表達(dá),Aurora-A、Aurora-B的過(guò)表達(dá)可引起細(xì)胞基因組不穩(wěn)定、有絲分裂錯(cuò)誤、細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)變,抑制其表達(dá)可抑制細(xì)胞的增殖、促進(jìn)細(xì)胞的凋亡。因此Aurora激酶家族已成為一個(gè)潛在的有價(jià)值的抗腫瘤治療靶點(diǎn)。目前已有許多Aurora激酶抑制劑被報(bào)道14-17,ZM447439(C29

6、H31N504x3H20)就是其中之一,屬ATP競(jìng)爭(zhēng)型抑制劑,它可阻止染色體排列、紡錘體檢查點(diǎn)功能和胞質(zhì)分裂。ZM447439處理的細(xì)胞不分裂即退出有絲分裂,細(xì)胞周期阻滯,多倍體增加,細(xì)胞體積變大,增殖能力下降,凋亡增加等18-19。Fiona Girdler20等通過(guò)RNA干擾和誘導(dǎo)突變等技術(shù)研究證實(shí)ZM447439引起腫瘤細(xì)胞的形態(tài)和生物學(xué)行為的改變是通過(guò)抑制Aurora-B激酶所致。
　　 因Aurora-B激酶只在分裂增

7、殖的細(xì)胞中表達(dá),而人類正常細(xì)胞多處于穩(wěn)定狀態(tài),腫瘤細(xì)胞分裂增殖活躍,故其抑制劑對(duì)腫瘤細(xì)胞有很強(qiáng)的選擇性。本文首先檢測(cè)了Aurora-B激酶在宮頸癌組織中高表達(dá),然后應(yīng)用ZM447439抑制Aurora-B并聯(lián)合順鉑(cisplatin cDDP)作用于宮頸癌細(xì)胞,研究其對(duì)細(xì)胞生物學(xué)功能的影響及與cDDP是否有協(xié)同效應(yīng)。以上問(wèn)題的研究目前在國(guó)內(nèi)外少見(jiàn)報(bào)道。通過(guò)本研究可為宮頸癌的靶向治療和臨床化療提供新的思路。
　　 實(shí)驗(yàn)材料及方法

8、：
　　 第一部分:應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)Aurora-B蛋白在不同富頸組織中的表達(dá),然后分析Aurora-B蛋白與宮頸癌各臨床病理參數(shù)的關(guān)系。
　　 第二部分:采用MTT方法檢測(cè)ZM447439對(duì)SiHa細(xì)胞增殖能力的影響;流式細(xì)胞技術(shù)分別檢測(cè)ZM447439對(duì)SiHa細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡的影響;顯微鏡和電鏡觀察SiHa細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變;蛋白印跡技術(shù)檢測(cè)Aurora-B和磷酸化組蛋白H3(H3-P)的表達(dá)變化。
　

9、　 第三部分:采用MTT、流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)ZM447439聯(lián)合順鉑對(duì)SiHa細(xì)胞增殖能力、細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡的影響;蛋白印跡技術(shù)檢測(cè)HPV16E6、P53、BCL-2、VEGF蛋白表達(dá)的改變。
　　 結(jié)果：
　　 第一部分:Aurora-B蛋白在宮頸癌組織高表達(dá),其次CIN,正常宮頸組織沒(méi)有陽(yáng)性表達(dá)。Aurora-B蛋白的表達(dá)與宮頸癌細(xì)胞的分化程度和病理類型有關(guān)(P＜0.05),與年齡,臨床分期,淋巴轉(zhuǎn)移情況無(wú)關(guān)(P＞

10、0.05)。
　　 第二部分:ZM447439以時(shí)間和劑量依賴的形式抑制SiHa細(xì)胞的增殖,引起細(xì)胞體積增大,數(shù)量減少,并出現(xiàn)凋亡改變。流式細(xì)胞技術(shù)顯示ZM447439引起細(xì)胞G2/M期阻滯,及促進(jìn)細(xì)胞早期凋亡。蛋白印跡技術(shù)顯示ZM447439抑制了Aurora-B和H3-P蛋白的表達(dá)。
　　 第三部分:MTT結(jié)果顯示順鉑以時(shí)間和劑量依賴的形式抑制SiHa細(xì)胞的增殖,和ZM447439聯(lián)用明顯增強(qiáng)了順鉑的抑制增殖、促進(jìn)凋

11、亡的作用,引起S期明顯抑制。抑制了HPV16E6、BCL-2、VEGF蛋白的表達(dá),增強(qiáng)了P53蛋白的表達(dá)。
　　 結(jié)論：
　　 第一部分:Aurora-B可作為宮頸癌治療的潛在靶點(diǎn)。Aurora-B在宮頸鱗癌和腺癌的發(fā)病機(jī)制中所起的作用可能存在差異。Aurora-B的表達(dá)與宮頸癌細(xì)胞的成熟程度有關(guān)。
　　 第二部分:抑制Aurora-B的表達(dá),進(jìn)而抑制其重要的下游因子H3的磷酸化,可以抑制宮頸癌SiHa細(xì)胞的增殖