杠柳順式--1，4--聚異戊二烯生物合成關(guān)鍵基因PsIPPI和PsCPT的克隆及功能分析.pdf

1、天然橡膠是事關(guān)國(guó)民經(jīng)濟(jì)和國(guó)家安全的一種重要戰(zhàn)略物資，主要成分為順式-1，4-聚異戊二烯。巴西橡膠樹(Hevea brasiliensis Muell.Arg)是目前天然橡膠原料的主要來(lái)源，由于受到該樹種熱帶生長(zhǎng)特性限制，我國(guó)種植面積有限，產(chǎn)能嚴(yán)重不足，開(kāi)發(fā)新的天然橡膠資源已成為我國(guó)迫切需要解決的問(wèn)題。
　　本研究首先從分析具有天然橡膠生產(chǎn)能力的植物入手，選擇了杠柳(Periploca sepiumBunge)作為我國(guó)生產(chǎn)天然橡膠替

2、代植物的研究對(duì)象;然后通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序等生物信息學(xué)手段，明確了杠柳順式-1，4-聚異戊二烯生物合成途徑的關(guān)鍵酶系及其所編碼的基因;利用基因的表達(dá)調(diào)控技術(shù)闡明了部分關(guān)鍵基因在杠柳順式-1，4-聚異戊二烯生物合成中的作用。本研究的研究結(jié)果如下:
　　1.以杜仲聚異戊二烯提取得率以及分子量分布為衡量標(biāo)準(zhǔn)，通過(guò)對(duì)材料預(yù)處理、提取方法進(jìn)行比較，確定了有效的聚異戊二烯分析測(cè)定方法。結(jié)果表明采用氯仿作為有機(jī)溶劑，在水浴下采用索氏提取杜仲聚異戊二烯

3、的方法最佳，在提取過(guò)程中使用超聲波輔助處理，可以進(jìn)一步促進(jìn)小分子或大分子的聚異戊二烯聚合物的溶出，提取更加充分。
　　2，以三種廣泛分布于我國(guó)西北、東北和華北等干旱、半干旱地區(qū)的野生灌木或草本植物，含乳汁成分的鵝絨藤（Cynanchum chinense R Br.）、羅布麻(Apocynum venetum L.)以及杠柳為材料，進(jìn)行聚異戊二烯提取和分析。通過(guò)對(duì)提取物進(jìn)行凝膠滲透色譜(GPC)分子量分析以及核磁共振(NMR)結(jié)構(gòu)

4、分析，發(fā)現(xiàn)杠柳中含有順式-1，4-聚異戊二烯成分，可作為生產(chǎn)天然橡膠原料的替代植物加以研究。
　　3.以杠柳的葉片、枝條和樹皮為材料，提取RNA進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析，從中篩選出杠柳順式-1，4-聚異戊二烯生物合成途徑的相關(guān)酶類及其編碼的基因，即杠柳異戊烯基二磷酸異構(gòu)酶(PsIPPI)、櫳牛兒基二磷酸合酶(PsGPPS)、法尼基二磷酸合酶(PsFPPS)、雙牻牛兒基二磷酸合酶(PsGGPPS)及順式-異戊烯基轉(zhuǎn)移酶(PsCPT)及其基

5、因，并進(jìn)行了生物信息學(xué)分析。
　　4.根據(jù)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果選擇了杠柳順式-聚異戊二烯生物合成途徑中的兩個(gè)關(guān)鍵基因，即PsIPPI和PsCPT,利用PCR方法全長(zhǎng)克隆，并以單獨(dú)或組合的形式構(gòu)建成三種基因過(guò)表達(dá)載體，以鑒定這兩個(gè)基因的功能以及對(duì)杠柳順式-聚異戊二烯生物合成的影響。
　　5.利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)方法將這三種基因過(guò)表達(dá)載體導(dǎo)入到杠柳植物體內(nèi)進(jìn)行過(guò)表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在杠柳中過(guò)表達(dá)PsIPPI基因?qū)ζ漤樖?1，4-聚異戊二烯的生物合