TNF-α，IL-1基因多態(tài)性與強(qiáng)直性脊柱炎發(fā)病機(jī)理的研究.pdf

1、[目的]： 1、檢測強(qiáng)直性脊柱炎(ankylosing spondylitis，AS)患者TNF-α基因啟動子-308位點和-857位點基因多態(tài)性與AS發(fā)病的關(guān)系，以及兩個位點聯(lián)合檢測對AS診斷的意義。 2、檢測強(qiáng)直性脊柱炎(ankylosing spondylitis,AS)患者IL-RN外顯子6上30735位點和31017位點基因多態(tài)性與AS發(fā)病的關(guān)系，以及兩個位點聯(lián)合檢測對AS 診斷的意義。 3、檢測強(qiáng)直性

2、脊柱炎(ankylosing spondylitis,AS)患者HLA-B27 基因多態(tài)性與AS發(fā)病的關(guān)系，以及兩種實驗室檢測方法的比較對AS診斷的意義。 4、檢測AS患者外周血單核淋巴細(xì)胞培養(yǎng)上清中TNF的含量與TNF-α基因啟動子位點基因多態(tài)性的關(guān)系。 [方法]： 1、AS患者的臨床分級 AS 病例診斷嚴(yán)格參照1984年紐約修訂AS診斷標(biāo)準(zhǔn)，并按CT結(jié)果分為Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ級。 2、TNF-α、IL

3、-1RN、HLA-B27 基因多態(tài)性的檢測 取AS患者和健康對照外周靜脈血1ml，1％EDTA 抗凝，鹽析法提取基因組 DNA，用 MJ PCR 擴(kuò)增儀按以下程序擴(kuò)增：95℃，4 min；然后按94℃25sec，56℃25sec，72℃25sec做40個循環(huán)，最后72℃5min，擴(kuò)增產(chǎn)物在玻片進(jìn)行芯片雜交，在 BaiO BE-2.0 生物芯片識讀儀(Cat＃ BSE 01011)的片槽上檢測。 3、外周血單核淋巴細(xì)胞細(xì)胞

4、培養(yǎng)上清中TNF含量的測定 取AS患者和健康對照肝素鈉抗凝靜脈血，分離外周血T淋巴細(xì)胞，吸出一部分血清，其余的進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，培養(yǎng)后的上清用ELISA 法檢測上清中TNF 細(xì)胞因子水平的表達(dá) [結(jié)果]： 1、AS患者TNF-α基因多態(tài)性與外周血單核淋巴細(xì)胞培養(yǎng)上清中TNF含量的綜合分析 在AS患者中TNF-α基因啟動子的-308位點的等位基因 A 頻率顯著性高于健康對照組(8％ vs 1.25％)，-308

5、GG基因型頻率顯著性低于健康對照組(84％vs97.5％)，其差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；在 AS 患者中TNF-α的-857C/T 的等位基因T頻率顯著性高于健康對照組(25％vs 9.52％)，基因型CT頻率顯著性高于健康對照組(42.59％vs 19.05％)，其差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。將-308位點的基因型 GG、GA 和-857 位點的基因型CC、CT 兩兩組合后發(fā)現(xiàn)，在健康人中-308GG/-857CC

6、組合要顯著高于AS患者，其差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，在 AS 患者中-308GG/-857CT組合要高于健康對照，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。將AS患者分為早期AS患者(CTⅠ、Ⅱ級)和晚期AS患者(CTⅢ、Ⅳ級)，發(fā)現(xiàn)晚期AS患者中外周血未刺激的細(xì)胞培養(yǎng)上清中TNF含量顯著高于健康對照和早期AS患者，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，TNF-α-308位點為GG 的患者中未刺激細(xì)胞培養(yǎng)上清中TNF的含量要顯著高于G

7、A的患者，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。TNF-α-308位點為GG的晚期AS患者中未刺激細(xì)胞培養(yǎng)上清中TNF的含量要顯著高于早期AS患者，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。 2、AS患者IL-1RN 基因多態(tài)性分析 AS患者中，IL-1RN的31017G和30735C的等位基因頻率(60.42％vs 36.36％，32％vs 17.19％)和基因型頻率(43.75％vs 12.12％，64％vs 39.39％)

8、顯著性高于健康對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。并且發(fā)現(xiàn)男性AS患者IL-1RN 的31017C/G 的等位基因頻率和基因型頻率顯著性高于健康對照組(61.84％ vs34.62％，47.37％vs 15.38％；P<0.01)。同時，IL-1RN 的 30735C/31017G 單倍體型在AS患者組中的分布頻率要高于對照組中的分布頻率，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。在 AS 患者中 30735CT/31017GG 基因

9、型組合頻率高于 健康對照(P<0.01)。 3、AS患者HLA-B27基因多態(tài)性分析 在AS患者中HLA-B27的B2704基因型頻率顯著性地超過健康對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，其中男性基因型頻率顯著高于健康對照組(P<0.05)，基因芯片技術(shù)檢測HLA-B27的敏感度為78％，特異度為93.94％；流式細(xì)胞法檢測HLA-B27敏感度為80％，特異度為96.97％，兩種方法檢測男性AS患者的敏感性都高于女

10、性，兩種方法檢測AS患者中的HLA-B27敏感性和特異性的差異并無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。 4、AS 患者TNF-α與IL-1 基因多態(tài)性的綜合分析 取AS患者和健康對照TNF-α基因啟動子-308位點(基因型GG和GA)、-857位點(基因型CC、CT、TT)、IL-1 外顯子的31017(基因型CC、CG、GG)和30735位點(CT、TT)2～4個位點，對取出位點的可能基因型組合，將AS患者和健康對照按取出的基

11、因型與非基因型組合分別計數(shù)進(jìn)行比較，在健康人中31017CG/857CC、31017CG/308GG 組合要顯著高于AS患者，其差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。在健康人中308GG/31017CG/857CC、308GG/30735TT/31017CG組合要顯著高于AS患者，其差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。將 IL-1 30735、IL-131017 和 TNF-857 位點基因型組合后發(fā)現(xiàn)，在AS患者中30735CT/310

12、17GG/857CT 組合要顯著高于健康人，其差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。 [結(jié)論]： 1、AS患者TNF-α基因啟動子-308位點和-857位點基因多態(tài)性與AS發(fā)病機(jī)制相關(guān)。 2、AS患者IL-RN外顯子6上30735位點和31017位點基因多態(tài)性AS發(fā)病有一定的關(guān)系。 3、AS患者外周血T淋巴細(xì)胞細(xì)胞培養(yǎng)上清中的TNF含量增加在AS病情的發(fā)生發(fā)展起到一定作用。 4、AS患者HLA-B2