漸狹蠟蚧菌(Lecdanicillium attenuatum)介導的RNAi對柑橘粉虱毒力探究.pdf

1、柑橘粉虱(Diaelorude citri Asahmaed)是廣泛存在于世界柑橘產區(qū)的重要害蟲。由于其具有刺吸式口器，可以吸食柑橘汁液，為害嚴重后引起落葉落果;更為可怕的是，柑橘粉虱可分泌黏性蜜露，蜜露將空氣中的灰塵吸附到葉片表面，并為一些霉菌提供營養(yǎng)物質，從而引發(fā)煤煙病，嚴重影響柑橘光合作用，造成減產。目前防治柑橘粉虱的主要方法是化學防治，但化學藥劑施用不當往往導致農藥殘留、昆蟲抗藥性等一系列的問題。漸狹蠟蚧菌（子囊菌綱，肉座菌目，

2、蠟蚧菌屬）作為一種重要的昆蟲病原真菌，它可以穿透粉虱體壁，消耗其營養(yǎng)，最終導致粉虱死亡，這為研制環(huán)保型微生物農藥提供了可能。但是由于漸狹蠟蚧菌毒力弱，侵染周期長，還很難與化學農藥競爭。本研究通過構建基于粉虱免疫基因的RNAi載體，將其轉化進入蠟蚧菌，以期真菌侵染粉虱之際，釋放dsRNA，對粉虱免疫基因實行干擾，減弱昆蟲對病原真菌的免疫反應，從而實現毒力的增強。實施步驟如下:
　　1.絲狀真菌RNAi載體的構建
　　以pBHt

3、2質粒為模板，擴增PtrpC啟動子和PtrpC+ HygR元件;以pAN7-1為模版，擴增TtrpC終止子;利用StuⅠ和XhoⅠ內切酶酶切掉pFGC5941的35S啟動子，置換上PtrpC啟動子，構建成PtrpC+ Intron結構;利用MssⅠ和SmaⅠ內切酶酶切掉pFGC5941的OCS終止子，置換上TtrpC終止子，構建成PtrpC+Intron+TtrpC結構;利用EcoRⅠ和PstⅠ內切酶酶切掉pFGC5941的MAS+Bl

4、pR元件，置換上PtrpC+ HygR元件。構建成PtrpC+ hygR+ PtrpC+ Intron+TtrpC結構。至此RNAi載體改造完成，并將改造后的載體命名為pRCy1。
　　2.基于粉虱免疫基因RNAi載體的構建
　　查找柑橘粉虱轉錄組數據庫，找到參與粉虱免疫相關的酚氧化酶原基因(PPO)、酚氧化酶原激活因子基因(PPO-AF)、溶菌酶基因(LZM)并設計引物，以cDNA為模板，克隆獲得PPO，PPO-AF，LZ

5、M以及PPO+PPO-AF融合基因的正反向結構，利用XhoⅠ和SwaⅠ酶切位點將以上4個基因的正向結構連入pRCy1載體;利用XbaⅠ和BamHⅠ位點將4個基因的反向結構連入pRCy1載體，構建完成ihpRNA表達盒。
　　3.農桿菌介導的ihpRNA表達盒轉化進入漸狹蠟蚧菌
　　將構建完成的RNAi載體電擊轉化進入EHA105農桿菌菌株，通過誘導培養(yǎng)和共培養(yǎng)，將質粒ihpRNA表達盒整合進入漸狹蠟蚧菌基因組中，在含有潮霉素

6、B的篩選培養(yǎng)基中獲得轉化成功的陽性菌株。
　　4.轉基因漸狹蠟蚧菌的效果評價
　　測定轉基因蠟蚧菌的單位產孢量和菌絲生長速率，發(fā)現與野生型菌株相比，轉基因菌株的生長速率沒有發(fā)生顯著性變化;而單位產孢量除La∷GFP菌株顯著增加外，其他菌株均沒有發(fā)生顯著變化。
　　將轉基因菌株在不含潮霉素B的PDA培養(yǎng)基上連續(xù)培養(yǎng)10代，利用特異性引物檢測菌株的遺傳穩(wěn)定性，發(fā)現第十代真菌均可擴增出陽性條帶。說明農桿菌介導的轉化蠟蚧菌具有